论文部分内容阅读
研究背景和目的肝癌是世界第五大常见癌症，在肿瘤相关的死亡中处于第三位。肝癌在肝脏中发生，可以分为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）和胆管细胞癌（intrahepaticcholangiocarcinoma，ICC)。肝细胞癌在原发性肝癌中最为常见，约占90%，其次为胆管细胞癌。最近有研究表明肝肿瘤干细胞在肝癌的发生、转移和复发中起着重要的作用。了解肝前体细胞和肝肿瘤干细胞的分化和自我更新机制对于建立肝癌干细胞靶向性的治疗具有重要意义。本课题的前期工作中发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂（Histone DeacetylaseInhibitor，HDACi）丁酸钠（Sodium Butyrate，NaB）可以诱导肝脏前体细胞LEPCs（Liver Epithelial Progenitor Cells）中Bmi-1(B lymphoma murine leukemia virusinsertion region1homolog）的表达水平下调，并诱导LEPCs分化为成熟肝细胞。Bmi-1属于多梳蛋白家族（Polycomb group，PcG）家族中的一员，多梳蛋白家族是维持多种组织干细胞自我更新的核心因子，在多种肿瘤中均高表达并且对肿瘤的发生具有很重要的作用。近期的研究也表明Bmi-1是肝癌干细胞的标志分子之一。本研究拟利用LEPCs和小鼠肝脏肿瘤细胞系研究Bmi-1在肝前体细胞和肝脏肿瘤细胞增殖中的作用；研究HDACi下调肝前体细胞和肝脏肿瘤细胞Bmi-1表达的分子机制；以及HDACi对肝脏肿瘤的治疗作用。实验方法在本研究中，首先通过表达Bmi-1shRNA的慢病毒感染小鼠肝原始细胞系LEPCs，观察LEPCs的形态变化；从基因和蛋白水平验证Bmi-1的干扰效率、检测细胞周期和细胞增殖能力及其干细胞特性指标。然后，用三种小分子HDACi (Sodiumbutyrate, NaB)，（Valproic Acid, VPA）和（Vorinostat，SAHA）分别处理小鼠肝癌细胞系Hepa1-6和H22细胞，通过定量PCR和Western blot分析Bmi-1在基因和蛋白水平表达变化，并确定HDACi对细胞增殖能力的影响。进而在小鼠肝癌细胞过表达外源Bmi-1，检测HDACi对过表达Bmi-1的肝肿瘤细胞增殖的影响。进一步通过定量PCR对Bmi-1的上游调控基因进行检测，探讨HDACi下调肝脏肿瘤细胞Bmi-1表达的机理。体内试验：以未经SAHA处理和以SAHA处理之后Hepa1-6细胞分别移植于C57BL/6小鼠左右腹股沟中，对照组注射PBS，实验组连续给药（SAHA，50mg/kg）3周后取组织，检测HDACi是否可下调体内肿瘤组织Bmi-1表达，并抑制肿瘤细胞的生长。将对照质粒和过表达Bmi-1的质粒转染Hepa1-6细胞后分别移植入C57BL/6左右腹股沟中，对照组注射PBS，实验组连续给药（SAHA，50mg/kg）3周后取组织，检测HDACi对过表达Bmi-1肿瘤大小和肿瘤细胞增殖的影响。同时利用H22细胞移植入昆明小鼠进行以上体内试验。Hepa1-6细胞经HDACi处理后，检测Bmi-1上游基因的表达，研究HDACi下调Bmi-1的分子基础。结果本研究发现，LEPCs转染Bmi-1shRNA后，Bmi-1的表达在蛋白和mRNA水平都显著显著下调；Ki-67免疫荧光染色显示细胞增殖能力明显降低；细胞周期分析表明细胞明显阻滞于G0/G1期；同时LEPCs中成熟肝细胞标志分子的表达上调。进一步，我们发现HDACi（包括NaB，VPA和SAHA）均可显著下调小鼠肝癌细胞系（Hepa1-6和H22）中Bmi-1的mRNA及蛋白表达，并显著抑制小鼠肝癌细胞的增殖。而过表达外源Bmi-1基因的Hepa1-6和H22细胞则可以耐受HDACi对细胞增殖的抑制作用。通过对Bmi-1上游调控基因的分析，发现HDACi可以显著下调肝癌细胞c-Myc的表达；过表达c-Myc后，HDACi对Bmi-1基因的表达抑制显著下降；表明HDACi通过c-Myc调控Bmi-1在肝癌细胞中的表达。体内试验发现，经SAHA给药后的小鼠Hepa1-6和H22细胞瘤体积的重量和体积均较对照组下降，同时SAHA可下调实体瘤中Bmi-1的表达，并抑制细胞增殖。而肿瘤细胞过表达外源Bmi-1后成瘤能力显著增强，且明显耐受HDACi对肿瘤细胞的生长，增殖能力的抑制作用。结论Bmi-1对于LEPCs细胞的自我更新和干性维持具有重要作用；HDACi可以通过下调Bmi-1来抑制小鼠肝癌细胞的生长；HDACi通过下调c-Myc的表达抑制Bmi-1的表达。本研究表明，表观遗传学靶向抑制Bmi-1是一种治疗肝癌的新方法。