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开花是有性生殖植物从营养生长向生殖生长的关键转折。延缓开花可在生产上避免“未熟抽薹”；提早开花可以加快品种选育进程；调节双亲花期有利于F1制种。芥菜开花时间主要受光照(例如日照长度、日照强度、光周期)、温度等外在环境以及植物生长状况、发育阶段已及遗传因素等内在条件影响。与拟南芥相似,主要有四条途径调节芥菜开花：春化途径、自主途径、光周期途径和赤霉素途径。尽管这四条途径分别有不同的基因网络调控,但最终都汇集到相同的开花途径整合子。目前,拟南芥中以分离出大量与开花时间相关的基因,如FLOWERING LOCUS T(FT)、SUPPRESSOR OF CO OVEREXPRESSION1(SOC1)、FLOWERING LOCUS C (FLC)和SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP)等,其中FT与SOC1促进开花,FLC与SVP抑制开花。由于芥菜是重要的十字花科蔬菜作物,属于种子春化类型,在我国南方广泛种植。因此,对芥菜开花时间调控的研究,在生产和实践中具有非常重要的意义。本实验以芥菜为研究材料,利用已报道的开花基因的保守区域设计简并引物,克隆了两个延迟开花的基因FLC与SVP,并构建了FLC及其截短体、SVP及其截短体的酵母双杂交重组表达载体,筛选与鉴定FLC与SVP相互作用及其蛋白互作的结构域。1、FLC与SVP的克隆与分析根据已发布的拟南芥和芸薹属作物中FLC与SVP基因的保守区域设计简并引物,从芥菜cDNA中扩增出FLC与SVP基因的全长cDNA。FLC基因含有625bp,编码197个氨基酸,属于MIKC型MADS蛋白,进化分析表明与芸薹属中甘蓝FLC(AAQ76273)亲缘关系最近。SVP基因含有757bp,编码241个氨基酸,也属于MIKC型MADS蛋白,与芸薹属中油菜SVP(AAQ55451)亲缘关系最近。2、全长FLC与SVP相互作用的鉴定利用同源重组技术,构建了FLC与SVP的酵母表达载体pGADT7FLCpGADT7SVPpGBKT7FLC和pGBKT7SVP。利用醋酸锂转化法将重组酵母质粒转化到感受态酵母中,得到酵母转化子Y187(pGADT7FLC)、Y187(pGADT7SVP)、 Y2HGold (pGBKT7FLC)和Y2HGold (pGBKT7SVP),经过不同缺陷型培养基鉴定,发现无自激活和毒性现象。融合的二倍体酵母Y187(pGADT7FLC)×Y2HGold (pGBKT7SVP)和Y187(pGADT7SVP)×Y2HGold (pGBKT7FLC)均能在选择型培养基SD/-Leu/-Trp/AbA (DDO/A)、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp (QDO)、 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA (QDO/X/A)上正常生长。结果表明,克隆到的芥菜FLC与SVP蛋白能够相互接合,为深入研究FLC-SVP作用位点建立一个技术平台。.3、FLC-SVP相互作用区域的筛选与鉴定从全长的FLC和SVP亚克隆了5个FLC截短体(FLC1～5)和5个SVP截短体(FLC1～5)。FLC1～5和SVP1～5编码蛋白的结构域均分别为MI、MIK、K、IKC和KC,并构建酵母重组表达质粒pGADT7SVP1～5和pGBKT7FLC1～5,并转化对应的酵母菌。二倍体酵母Y187(pGADT7SVP2-5)×Y2HGold (pGBKT7FLC)和Y187(pGADT7SVP)×Y2HGold (pGBKT7FLC2-5),在QDO/X/A培养基上长出蓝色菌落,同时激活了酵母的报告基因AUR1-C, HIS3、ADE2、MEL1。由此表明,FLC与SVP2-5能够相互作用,同时SVP与FLC2～5也能互作,从而暗示SVP与FLC的K域是介导FLC-SVP二聚化的核心部位。进一步研究发现,Y187(pGADT7FLC3)×Y2HGold (pGBKT7SVP3)和Y187(pGADT7SVP3) xY2HGold (pGBKT7FLC3)二倍体酵母,在QDO/X/A培养基上长出蓝色菌落,表明FLC3与SVP3能互作,进一步证实了K域是FLC-SVP相互作用的核心区域。