中药诃子是临床中常用的藏药,其临床功效、作用特点以及作用机制都较为明确,临床应用十分广泛。但是截至目前国内外关于诃子的毒理学研究开展得较少,尚没有足够的研究数据来评价诃子的毒性情况。药物高内涵筛选分析技术(High Content Screening, HCS)是指在细胞水平针对生物体内的多系统、多途径及多靶点进行动态筛选,不仅能了解受试药相关的细胞生物学变化,阐明受试药与靶点之间相互作用的关系,还能通过观察细胞形态等变化预测受试药的毒性,从而实现受试药的生物活性和毒性的早期、快速及高通量检测方法。因此,本课题在综合考察诃子肝毒性的基础上,包括诃子的急性毒性、亚急性毒性、量-毒关系、时-毒关系及肝毒性机制研究实验,对诃子肝毒性进行综合评价。并在明确诃子具有肝毒性后,以诃子为研究对象,尝试建立高内涵肝毒性筛选方法,旨在找到一种能在早期进行中药肝毒性筛选的方法。本课题研究工作分为两部分：第一部分,诃子水煎液肝毒性基础研究；第二部分,高内涵肝毒性筛选方法的建立及验证。第一部分诃子肝毒性基础研究一、绒毛诃子水煎液小鼠急性毒性实验目的：研究单一来源为绒毛诃子的中药诃子毒性程度。方法：观察绒毛诃子水煎液对小鼠的急性毒性及最小致死量。实验动物分为6组,分别口服给予不同浓度的药液,给药后连续观察14d,记录各组小鼠毒性症状,死亡数量。结果：口服给药,部分小鼠出现竖毛,不活泼,水样下痢等症状；严重者可出现腹卧位、不能站立,正向反射消失。给药后2h即出现动物死亡,动物死亡前出现呼吸加快；死亡动物剖检,肉眼观察未发现脏器有明显变化；绒毛诃子水煎液最小致死量为28.4 g生药/kg,为人用剂量的170.1倍。结论：虽然本实验表明绒毛诃子具有一定的毒性,但是其毒性靶器官不一定是肝脏。因此,不选择该基源的诃子作为下一步实验的研究对象。二、诃子水煎液小鼠急性毒性实验及大鼠亚急性毒性实验目的：研究单一来源为诃子的中药诃子的毒性程度。方法：①诃子水煎液小鼠急性毒性实验。观察诃子水煎液对小鼠的急性毒性反应及半数致死量。实验动物分为6组,分别口服给予不同浓度的药液,给药后连续观察14d,记录各组小鼠毒性症状,死亡数量。②诃子水煎液大鼠亚急性毒性实验。每天按不同剂量(分别分别给予16.0、8.0、4.0g生药·kg-1BW)口服灌胃大鼠1次,连续给药28d。末次给药结束后,大鼠禁食12h,之后取动物血液进行血液学及生化指标的检测。取动物主要脏器进行脏器系数及病理切片的检测。结果：①诃子水煎液小鼠急性毒性实验。口服给药后0.5h,小鼠出现竖毛,不活泼,软便等症状；给药后24h,部分动物出现嗜睡,消瘦,步态不稳等症状,并且出现动物死亡；死亡动物剖检,肉眼观察肝脏出现明显异常；诃子水煎液的LD50值为9.7583g生药/kg,为人用剂量的58.4倍。②诃子水煎液大鼠亚急性毒性实验。大剂量组大鼠体重与空白组相比有所减轻,且具有统计学差异。其余各组与空白组相比,无统计学差异。各个给药组脏器系数与空白组相比无显著性变化,且各脏器病理切片观察时未发现明显异常。通过检测大鼠的血液学指标发现给药组大鼠血液中的WBC、HGB、HCT、MCV与空白组相比具有统计学差异,但是没有生物学统计意义。通过检测大鼠的血清生化指标发现给药组大鼠血清中ALT、AST、TP、Urea、CR、CHO、TG、TBIL含量与空白组具有统计学差异,但是无生物学统计意义。结论：基源为Terminalia chebula Retz.的诃子水煎液对小鼠存在一定的肝毒性风险。虽然大鼠亚急性毒性实验未显示该基源的诃子其对大鼠存在肝毒性风险,但是考虑可能是由于给药剂量未达到其毒性剂量所致。因此本课题接下来将选用来源为Terminalia chebula Retz的诃子进行下一步研究,并且选用ICR小鼠为实验动物进行其肝脏毒性的量-毒关系与时-毒关系。之后再以其为研究对象,尝试建立高内涵肝毒性筛选方法及方法验证。三、诃子水煎液诱导小鼠急性肝损伤实验研究目的：研究诃子水煎液诱导小鼠急性肝损伤。方法：取小鼠按不同剂量分组,单次灌胃给予不同剂量的诃子水煎液,分别为16.0、12.0、8.0g生药·kg-1BW。于给药后24h进行腹主静脉取血,检测其血清生化指标。之后处死小鼠并且剥离出肝,计算其脏器系数及进行病理切片观察。结果：①小鼠单次服用诃子水煎液24h后,其体重减轻,肝脏变小且肝脏系数减小。②小鼠血清中的ALT、AST、Urea、Cre及ALP水平与空白组相比,具有显著性变化,且呈剂量依赖性。③组织病理学检查：给与不同剂量的诃子水煎液的小鼠其肝脏呈现不同程度的坏死。结论：初步研究表明小鼠单次大剂量服用诃子水煎液存在引起肝损伤的风险,且其毒性呈现一定的剂量依赖性。四、诃子水煎液单次给药致小鼠肝损伤“时-毒”关系研究目的：研究诃子水煎液单次给药致小鼠肝损伤“时-毒”关系。方法：取小鼠按不同剂量分别两组,分别给予9 g及6g生药·kg-1BW。于给药后1,2,4,6,12,24h,进行腹主静脉取血,检测其AST及ALT值的变化。之后处死小鼠并且剥离出肝,进行病理组织学检查。结果：①小鼠单次服用9g生药/kg的诃子水煎液后,血清中ALT、AST水平随时间的延长,有不同程度的升高。小鼠在给药后1h,血清中ALT和AST值出现升高,与空白组相比,具有显著性差异。给药后24h,小鼠血清中的AST和ALT水平骤然升高,且肝脏组织病理形态学检查显示小鼠在给药后24h,肝脏出现大面积坏死。②小鼠单次服用6g生药/kg的诃子水煎液后,血清中ALT和AST水平在开始一段时间内具有一定程度的升高,且与空白组相比,具有显著性差异。但是在给药后12h,小鼠血清中的ALT、AST水平逐渐恢复到正常水平。结论：初步研究表明小鼠单次服用9g生药/kg的诃子水煎液会导致其出现肝脏损伤,且其毒性特点为具有一定的潜伏期,在潜伏期内病情缓和,肉眼无法观察出异常。潜伏期结束后,病情出现急剧恶化甚至在短时间内导致死亡。第二部分高内涵肝毒性筛选方法的建立及验证一、诃子水煎液沉淀与上清液高内涵肝毒性分析目的：基于高内涵肝毒性分析方法,观察沉淀与上清液对HepG2肝细胞毒性,并初步探查其可能的损伤机制。方法：在HepG2人肝癌细胞上,采用高内涵分析技术,进行沉淀与上清液的细胞毒性(细胞数量、DNA含量、GSH降低水平、ROS含量及线粒体膜电位)的多参数分析。结果：①沉淀作用于HepG2细胞24h后,结果表现为细胞数目、DNA含量、ROS水平及MMP均为阴性,而GSH降低水平结果为阳性。通过量-毒反应折线图显示,沉淀从62.5μg·m1-1开始,其GSH降低水平超过阈值上限,而另外四个指标的各个浓度均在阈值范围内。沉淀引起肝毒性可能是由于GSH水平降低导致。②上清液作用于HepG2细胞24h后,结果表现为细胞数目、DNA含量、GSH降低水平、ROS水平及MMP均为阳性。通过量-毒反应折线图显示,上清液在最大剂量1000μg·ml-1时,其细胞数目水平低于闽值,MMP高于阈值；上清液从3125μg·ml-1开始,出现DNA含量升高、GSH降低水平升高及ROS含量升高,且超过阈值范围。这表明上清液开始引起肝损伤是由于GSH水平降低、活性氧过度产生及DNA异常导致,随着剂量的加大,从而出现细胞的直接损伤及线粒体的损伤。结论：研究初步表明沉淀与上清液均存在诱导肝损伤的风险,且上清液风险较沉淀大。这表明沉淀产生细胞毒性的主要原因是GSH含量减少,细胞清除自由基能力减弱有关,并具有剂量依赖性。上清液早期产生细胞毒性的原因主要是DNA的聚集、GSH含量减少及氧自由基的过度产生,之后随着剂量的加大,出现细胞数目的减少及MMP的改变。二、MTT法与HCS技术在细胞增值率上的一致性考察目的：采用MTT法考察HCS技术在细胞增值率上的一致性。方法：采用MTT法检测了HepG2在沉淀与上清液作用24h后的细胞增殖率,并将结果与高内涵分析结果进行一致性考察。结果：沉淀与上清液对HepG2细胞增殖无抑制作用。用HCS分析技术测得的活力与MTT法测得的之比分别平均为1.11±0.08与1.01±0.06,RSD分别为7.59%与5.83%。结论：初步表明其具有较好的相关性,而且高内涵分析技术相较于MTT法具有较大的优势。三、整体动物实验与HCS技术在毒性结果判断上一致性考察目的：采用整体动物实验考察HCS技术在毒性结果判断上一致性。方法：采用整体动物实验检测沉淀与上清液对ICR小鼠血清中的ALT、AST水平的影响,研究其毒性结果判断与高内涵分析结果是否一致。结果：沉淀对小鼠血清中的AST水平无显著性影响,但ALT水平较空白组具有显著性升高。上清液使小鼠血清中的ALT、AST水平升高,且与空白组相比具有统计学差异。结论：研究研究结果初步表明沉淀与上清液均存在诱导肝损伤的风险,且沉淀引起肝损伤的程度较上清液轻。这一实验结论与高内涵分析结果相一致,表明高内涵分析技术是有效可靠的。四、蛋白质组学技术与HCS技术在毒性机制上的一致性考察目的：采用蛋白质组学技术考察验证HCS技术在毒性机制上的一致性。方法：采用蛋白质组学技术研究上清液诱导小鼠肝脏差异蛋白的表达,从而探讨其毒性机制,研究其毒性机制与高内涵分析结果是否一致。结果：上清液对小鼠肝脏中的蛋白质表达具有显著性影响。从中解析出20个蛋白,分别为苹果酸脱氢酶、延胡索二酰乙酰乙酸酶、NAD H脱氢酶[泛醌]铁硫蛋白2、ATP合成酶α亚基、乳酰谷胱甘肽裂合酶(乙二醛酶)、硫代硫酸硫转移酶、甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶1、细胞色素b5、氨甲酰磷酸合成酶、烟酸磷酸核糖转移酶、电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1、乙酰辅酶A乙酰基转移酶、钙网蛋白、钙调素等。这些差异蛋白涉及机体的氧化应激反应,氨基酸代谢,能量代谢等过程。结论：初步表明诃子水煎液上清液引起肝脏毒性的机制与高内涵分析结果相一致,这表明高内涵分析技术能有效的阐明上清液的毒性作用机制。五、上清液中不同极性分离部位高内涵肝毒性分析目的：基于高内涵肝毒性分析方法,观察上清液中不同极性部位对HepG2肝细胞毒性,并初步探查其可能的损伤机制。方法：采用HCS分析技术,进行上清液不同极性部位的细胞毒性(细胞数量、DNA含量、GSH降低水平、ROS含量及线粒体膜电位)的多参数分析。结果：①C极性部位作用于HepG2细胞24h后,结果表现细胞数目和ROS含量检测结果均为阴性,而DNA含量、GSH降低水平及MMP检测结果为阳性。C极性部位在GSH降低水平上自15.6μg·ml-1浓度开始,其GSH降低水平超过正常阈值,但是随着剂量的升高,其GSH降低水平并没有逐步升高,表明其无直接的量-毒关系曲线；在DNA含量指标上,C极性部位也自15.61ag·ml-1浓度开始,其DNA含量稍微低于正常阈值范围,且在这个指标上也没有直接的量-毒关系；在MMP指标上,C极性部位在15.6～500μg·ml-1范围内低于正常阈值。②D极性部位作用于HepG2细胞24h后,结果表现为细胞数目和ROS含量检测结果均为阴性,而DNA含量、GSH降低水平及MMP检测结果为阳性。在GSH降低水平指标和DNA含量指标上, D极性部位仅在500μg·ml-11这一浓度是上超过正常阈值水平；在MMP指标上,D极性部位在31.25-500μg·m1-1范围内低于正常阈值。③E极性部位在细胞数目、DNA含量、ROS含量及MMP检测结果均为阴性,而GSH降低水平为阳性。GSH降低水平在62.50～500μg·ml-1范围内超过正常阈值范围。④F极性部位在细胞数目、DNA含量、ROS含量、GSH降低水平及MMP检测结果均为阴性均为阳性。结论：初步表明GSH降低水平是这四个极性部位的共同毒性指标。GSH主要在肝脏内合成,具有强大的还原作用,其能有效的清除机体内的氧自由基,从而保护肝细胞。另外,虽然C、D、E在ROS指标上均为超出正常阈值范围,但是其ROS水平随着剂量的升高而升高,且F极性部位在ROS指标上结果为阳性。因此表明脂质过氧化将会成为C.D.E.F四个极性部位导致机体出现肝毒性的主要机制。