论文部分内容阅读
目的:药物转运蛋白在药物体内代谢过程中的重要作用及研究价值越来越多地受到研究者的关注。Mrp2,Bcrp是位于肝细胞胆管侧膜上的ABC族转运蛋白,可转运许多内源性物质和外源性物质(如药物),许多药物也可调节转运蛋白的表达。头孢妥仑是第四代头孢菌素类抗生素,研究介导其胆汁排泄的肝脏药物转运蛋白,对预测与头孢妥仑相关的药物间相互作用及了解β-内酰胺类抗生素的胆汁排泄机制有重要意义;了解药物对药物转运蛋白表达情况的影响能够使我们更清楚地从转运蛋白分子水平理解药物的体内动力学变化,从而为临床合理用药提供理论依据和指导。本实验通过in situ和in vivo方法研究参与头孢妥仑胆汁排泄过程的药物转运蛋白及头孢妥仑口服给药后对肝脏主要转运蛋白表达的影响。方法:采用肝灌流实验方法,研究头孢妥仑是否经Mrp2、Bcrp或P-gp的转运;采用RT-PCR和Western blot实验,考察头孢妥仑对肝脏主要转运蛋白表达的影响:(1)肝灌流实验,设立对照组(头孢妥仑(1μΜ))和实验组(头孢妥仑(1μΜ)和丙磺舒(Mrp2抑制剂)、新生霉素(Bcrp抑制剂)或维拉帕米(P-gp抑制剂)(20μΜ)),灌流Wistar大鼠肝脏,在设定时间点收集出口灌流液和胆汁样品,高效液相色谱法测定样品中头孢妥仑含量,考察实验组和对照组中肝摄取率和胆汁累积排泄率的差别;(2)大鼠灌胃给药,设立对照组(生理盐水)和头孢妥仑16mg/kg, 50mg/kg, 100mg/kg三个不同的剂量组,每天两次,一周后,取肝脏,提取总RNA,进行RT-PCR反应,检测Mrp2,Bcrp,P-gp,Oct1和Oat2的mRNA的表达变化;(3)采用超速离心法提取膜蛋白Mrp2,运用Western blot方法测定不同剂量组中Mrp2蛋白表达的变化,考察其变化是否有剂量依赖性。结果:(1)肝灌流实验结果表明,实验组和对照组相比,肝摄取率变化无统计学意义上的差别;在丙磺舒抑制剂组,肝脏灌流25分钟后,大鼠的头孢妥仑胆汁累积排泄率降低至对照组的43.78%;新生霉素组的胆汁累积排泄率降至对照组的79.52%;维拉帕米做P-gp抑制剂时,头孢妥仑的胆汁累积排泄率与对照组相比,无统计学意义上的差别。(2)大鼠灌胃给予头孢妥仑一周后,Mrp2,Bcrp和Oat2 mRNA的表达增多,且100mg/kg剂量组mRNA表达明显多于16mg/kg剂量组;P-gp和Oct1的mRNA表达减少,与头孢妥仑剂量的增加呈反向变化。(3)Western blot与RT-PCR结果一致,Mrp2蛋白表达增多,且100mg/kg剂量组中Mrp2蛋白表达是对照组的1.7倍,16mg/kg剂量组中Mrp2蛋白表达是对照组的1.32倍。结论:(1)Mrp2在头孢妥仑的胆汁排泄过程中起主要作用,Bcrp也参与其胆汁排泄过程,而P-gp不介导头孢妥仑的胆汁排泄;(2)头孢妥仑可增加Mrp2,Bcrp和Oat2的mRNA表达,减少P-gp和Oct1的mRNA表达,且这种调节作用有剂量依赖性;(3)Western blot实验进一步证实了头孢妥仑可增加Mrp2的蛋白表达,且有剂量依赖性,为阐述药物间相互作用和临床合理用药提供了重要依据。