ProUK较其它典型的丝氨酸蛋白酶原的内在活性高约1000倍，实验证明位于柔性环区（Gly297～Lys313）的Lys300与Asp355侧链残基之间的电荷作用是proUK高内在活性的一个决定因素。影响该环区柔性的突变也能调节proUK的内在活性。纤维蛋白（fibrin）降解的E片段显著促进proUK诱导的纤维蛋白溶解酶原（Glu-plasminogen）的激活，而fibrin降解的D2片段对上述激活反应则没有作用。根据与tPA的序列同源性比较和UK的晶体结构数据以及对proUK三维模拟构象分析，我们推测proUK的Pro309残基对维持柔性环区的构象及底物专一性具有重要作用，因此我们对编码proUK第309位Pro的密码子进行了盒式突变，并对部分突变体的性质进行了鉴定。结果表明，Pro309突变仅使plasmin对突变体的激活作用略有影响，而单链突变体对小分子底物S2444的水解活性下降了3.7～39倍，对应的突变体双链水解S2444以及激活Glu-plasminogen的活性分别下降了1.1～16倍和1.2～127倍。其中，当Pro309突变为Trp/His（具有较大侧链的氨基酸）以及Arg/Asp（具有带电荷的侧链氨基酸）时，突变体单链活性以及双链活性的下降最为显著；当Pr0309突变为Gly/Ser（具有较小侧链的氨基酸），突变体单链以及双链活性变化较小。 与proUK不同的是，Pro<’309>突变体诱导的Glu-plasminogen的激活不仅受到fibrin降解的E片段，而且受到fibrin降解的D2片段的显著促进。提示Pro<’309>残基可能参与形成proUK分子和plasminogen结合的第二作用位点，该位点的变化能显著影响proUK的底物专一性。2.0μM的D2片段能够使Pro<’309>→His突变体诱导Glu-plasminogen的激活作用提高22倍，但Pro<’309>→Gly突变体在同样条件下的激活作用仅增加了2.0倍。综上所述，proUK柔性环区的构象变化不仅能影响其内在活性及双链活性，而且改变了proUK的底物专一性。 本文的第二部分对多肽药物的基因工程制备方法进行了研究。用RT-PCR扩增肠激酶轻链（EKLC,Enterokinase Light Chain）的cDNA，并克隆至酵母分泌型表达质粒pPICZαA中。将重组质粒pPICZαA/EKLC转化至表达宿主pichia pastoris GS115，经甲醇诱导，目标蛋白EKLC表达并分泌至酵母培养基中。采用Zn-Sepharose亲和层析一步纯化，从每升培养液可获得1.6mg EKLC，其纯度达90％以上。酶反应动力学结果表明，EKLC催化小分子底物Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-naphthylamide水解的K<，m>为753±42μmol/L，K<，cat>为31.5±3.8s<’-1> 以pET32a为表达载体，构建了硫氧还蛋白－脑钠素（thioredoxin-hBNP）融合蛋白表达质粒，并转化至大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导，融合蛋白的表达量占全菌蛋白量的25％以上。融合蛋白经肠激酶裂解、Zn-Sepharose亲和层析和C4反相高效液相层析，从每升培养液中可获取4mg rhBNP，纯度达到95％。经质谱测定，rhBNP样品的分子量为3464Da。体外活性测定结果表明，rhBNP样品对兔胸主动脉条具有显著的血管舒张效应，其EC<，50>为（2.24±0.58）×10<’-6>mg/mL。 此外，我们还利用蛋白质内含子（intein）的自我剪切功能制备了重组人hBNP。将化学合成的hBNP基因插入到表达载体pTWINl中几丁质结合区（chitin binding domain，CBD）和SspDnaB微型蛋白质内含子（dnaB）基因的下游，将表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），并用IPTG诱导融合蛋白表达。CBD-DnaB-hBNP融合蛋白在大肠杆菌中形成包涵体。经复性处理后，融合蛋白用几丁质（Chitin）亲和柱吸附纯化。将吸附了融合蛋白的Chitin柱的pH调节至7.0，并在25℃保温16小时以促进SspDnaB微型蛋白质内含子介导的肽键切割作用，使hBNP从融合蛋白中释放出来。经反相HPLC纯化，获得了具有生物活性的高纯度的hBNP样品。该方法为不采用蛋白水解酶或化学裂解试剂制备低分子量多肽提供了一条新途径。