氯乙基亚硝基脲（CENUs）是临床上一类重要的抗癌烷化剂，该类药物在发挥抗癌作用的同时能够诱发白血病等二次肿瘤的产生，其致癌副作用不容忽视。研究表明其抗癌和致癌机制均与导致DNA股间交联有关。因此，研究药物导致的DNA交联能够为CENUs抗癌与致癌作用之间的差异提供参考，对癌症的预防和治疗具有不可忽视的重要意义。本课题以此为出发点研究CENUs导致DNA股间交联的作用程度和交联率的变化趋势。主要采用变性凝胶电泳、荧光方法和高效液相色谱.质谱联用（HPLC-MS）方法对CENUs导致的DNA股间交联进行定性和定量检测分析。　　 首先，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（dPAGE）检测司莫司汀（Me-CCNU）与DNA的股间交联。四种不同GC含量（0％、38％、54％和76％）的合成DNA与Me-CCNU反应的交联产物经dPAGE进行分离，电泳结果显示经Me-CCNU作用的GC含量为0％的DNA没有股间交联，而其它三种DNA中均有交联生成，表明Me-CCNU能导致GC碱基对交联，而不能导致AT碱基对交联。该方法操作简单，但灵敏度较低，无法检测交联率，仅适用于定性分析。因此，又使用了灵敏度更高的实时荧光方法进行定量分析。　　 然后，使用实时荧光法研究了不同浓度的司莫司汀（Me-CCNU）、卡莫司汀（BCNU）和尼莫司汀（ACNU）导致λDNA交联的情况。结果表明Me-CCNU和ACNU对λDNA的交联反应初期均存在一个交联率上升缓慢的“诱导期”，“诱导期”后交联率随反应时间明显上升，在8小时左右达到稳定的最大值。BCNU导致的交联率则没有“诱导期”，由于分解较快使得DNA的单碱基烷化产物迅速增多从而推动了交联反应的进行。BCNU对DNA的交联率在反应后期有明显的下降趋势说明BCNU可能导致了DNA断链。实时荧光法与荧光分光光度法相比检测更加迅速，从而避免了由于测量时间长导致荧光强度衰减而引起的误差，因此是一种简便、高效、稳定的DNA交联检测方法。　　 最后，使用高效液相色谱-电喷雾串联质谱（HPLC-ESI-MS/MS）联用方法对Me-CCNU导致DNA股间交联的产物进行检测。由于通过荧光方法测得的交联率是交联DNA双链的含量，而一条交联双链中可能含有多个交联的碱基对，为了从本质上探讨交联率的变化规律，我们使用HPLC-ESI-MS/MS联用方法对Me-CCNU导致DNA股间交联的碱基对进行了定量分析检测。首先将与亚硝基脲反应后的DNA样品经过酶解和离心过滤得到单个核苷，然后经反相色谱分离。使用质谱的选择反应扫描（Selecting Reaction Monitoring，SRM）模式监测。m/z521→m/z289的离子通道，对HPLC中分离出来的dG-dC交联进行定量分析。经过计算，得到了每107个碱基对中生成dG-dC交联的个数。结果表明，GC含量分别为38％、54％和76％的DNA双链中交联率均随反应时间呈上升趋势，并且均可以明显看到“诱导期”的存在。此外，DNA双链中GC含量越高，在相同反应时间和相同药物浓度下，生成的dG-dC交联越多，表明CENUs导致DNA交联具有一定的序列选择性。　　 综上所述，本课题分别使用变性电泳、实时荧光和HPLC-ESI-MS/MS方法对CENUs导致的DNA股间交联进行了检测。变性电泳方法作为一种定性分析的方法，重复性好、操作步骤相对比较简单，但是由于灵敏度低，不能满足交联率较低的样品分析，故不适用于定量分析。实时荧光方法灵敏度高、分析速度快，因而适用于对交联DNA双链的定量分析。HPLC-ESI-MS/MS方法检测交联不仅灵敏度和准确性高，而且与实时荧光方法相比，它检测的是交联碱基对dG-dC而不是交联的DNA双链。因此，HPLC-ESI-MS/MS方法更能从本质上揭示交联率的变化规律，同时比实时荧光方法具有更高的稳定性和重复性。HPLC-ESI-MS/MS方法得出的交联率进一步表明，在交联反应的初期明显存在一段交联率上升缓慢的诱导期，这不仅为阐明交联机理提供了依据，同时为进一步探讨交联反应动力学提供了可靠的方法。