皮肤是人体最重要的防御屏障,但因其直接与外界环境接触,也最易受到各种损伤和疾病的伤害从而导致皮肤缺损,除了常规疗法外,可以使用组织工程皮肤来修复。复方壳多糖组织工程皮肤作为一个较理想的三维模型,一直采用传统的静态培养方式,虽然技术已较为成熟,仍面临培养时间较长、工作量大、偶有污染等缺点。而新兴的灌注式培养这一动态培养的方法可以避免诸多静态培养无法避免的问题。目前已研制的灌注式培养模式有五层重叠式、MINUTH灌注式培养等方法,但是对培养的细胞有较强的针对性,应用相对局限,且培养出的细胞与静态培养相比活力比较接近,优势并不是十分突出。我们在本次实验中使用的灌注设备是我们自行研制的叠层式生物反应器,在进一步改进、优化后以求能达到更好的细胞培养效果。通过初步采用灌注式培养方法培养了组织工程皮肤,采用不同灌注流速比较组织工程真皮的细胞增殖情况,研究不同营养浓度对组织工程皮肤形态结构及细胞增殖凋亡的影响,为进一步改善灌注培养条件提供更多依据,为灌注式培养在组织工程皮肤方面的深入应用打下了基础。目的:1、简要分析、比较目前我们采用的灌注式培养器低流速与高流速流场的均匀性与剪切力。2、研究不同灌注流速对组织工程皮肤真皮细胞增殖的影响,初步摸索出较适合组织工程真皮动态培养的灌注速度。3、比较不同营养浓度对组织工程双层皮肤形态结构及细胞增殖凋亡的影响,摸索较适宜细胞生长的营养浓度条件。方法:1、利用计算流体动力学(Computational Fluid Dynamics,CFD),采用两相流模型进行三维流场计算模拟,进行流场均匀性与剪切力的分析。2、酶消化分离青年男性包皮标本获得成纤维细胞,并进行培养、传代,使用第2代成纤维细胞构建复方壳多糖组织工程真皮。在低流量(80ml/min)及高流量(800ml/min)的灌注速度条件下培养复方壳多糖组织工程真皮,用MTT法检测两个流速状态下真皮细胞的存活和增殖情况,并做统计学分析。3、使用第2代角质形成细胞构建含表真皮的复方壳多糖组织工程双层皮肤。将其分别置于含40%及80%低糖DMEM的培养基下进行灌注式培养,分别于5天及10天取材,进行HE染色观察细胞形态,利用ki67检测细胞增殖情况,TUNEL染色检测细胞凋亡,计数阳性细胞数并作统计学分析。结果:1、我们研制的灌注设备结构在流量较低时(如80ml/min时),营养液速度、动静压、流场漩涡度、速度梯度、流场矢量等指标能够保证很好的均匀性。当流量增大时,全场流速增大,动静压也有不同程度增高,流场失去均匀性特性。2、MTT的结果显示随着培养时间的延长,低流速灌注条件下组织工程真皮内的MTT值随着培养时间的增加而增加,提示真皮内的活细胞数不断增加,细胞处于持续增殖状态。另外,低流速灌注培养下的细胞活力显著高于静态培养。而高流速灌注情况下的细胞活力较静态培养差。3、低流速灌注培养的组织工程皮肤细胞在HE染色下形态较好,真表皮双层结构清晰,表明在灌注培养下,组织工程皮肤仍能获得较好的营养供应。4、免疫组化检测ki67的结果显示:表皮和真皮内的ki67阳性细胞数在80%浓度的DMEM培养基培养时都显著高于40%浓度的DMEM培养基(P<0.05)。与80%浓度培养5d相比,80%浓度培养10d时真皮层内ki67阳性细胞数,显著减少(P<0.05)。5、用TUNEL检测培养基的浓度对双层组织工程皮肤内细胞凋亡的影响,经统计,真皮和表皮内凋亡细胞数量表明40%浓度DMEM培养组显著高于80%浓度DMEM培养组(P<0.05)。与80%浓度DMEM培养5d相比,80%浓度培养10d的表皮层内凋亡细胞数量显著增加(P<0.05)。结论:灌注设备在流速较低时(80ml/min时),流场的各项流动指标能够保证很好的均匀性,是合适的灌注流速,且灌注式动态培养模式优于静态培养,适用于组织工程皮肤的培养。营养条件的比较上,80%培养基浓度优于40%培养基浓度的培养效果。