研究背景及意义：肝门部胆管癌,又叫Klatskin瘤,是指原发于胆囊管开口以上肝总管或左右肝管的胆道上皮源性恶性肿瘤,约占肝外胆管癌的60%--75%。其发病隐匿,早期诊断困难,病人预后相对较差且致死率高。目前肝切除或者肝移植是唯一能够有效清除此肿瘤的治疗方式,但是由于大部分肝门部胆管癌早期即呈浸润性生长,且肝门部解剖结构复杂,RO切除率也只有30%左右,并且术后复发率较高,加上常规化疗和放疗效果有限,因此积极探寻与肝门部胆管癌发生和进展相关的基因及其功能有可能为肝门部胆管癌的靶向治疗提供新的思路和方向。TROP2(又叫EGP-1, MIS1, GA733-1),是一种TACSTD基因家族的细胞表面糖蛋白,由323个氨基酸组成,分子量约为36kDa,因最早发现其在滋养层细胞和子宫绒毛膜癌表达水平较高而得名,胚胎滋养层细胞主要位于胚泡的外层,一定的环境下滋养层细胞能侵入子宫基质和血管进而取代螺旋动脉的平滑肌和内皮细胞,是胎盘具有侵袭和转移特性的部分。TACSTD家族另一成员EpCAM是一种细胞粘附分子,后来发现其作用并不仅仅局限于细胞与细胞之间的黏附,而且还能激活细胞内MAPK和PI3K/AKT等信号途径,从而引起肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等生物学行为,然而最近研究发现结肠癌中EpCAM能在TACE和presenilin-2的催化作用下发生膜内蛋白水解进而释放胞内结构域EpICD进入细胞核,和FHL2、β-catenin以及Lef1形成核内复合体从而启动某些靶基因的转录。但是目前关于TROP2在肿瘤发生和进展中的作用以及机制研究还不是很深入,从结构上来讲TROP2不仅包含一个保守的PIP2结合域和一个能与PKC相互作用的丝氨酸磷酸化位点,而且还能够传递细胞内的钙信号；最近临床研究表明TROP2在结肠癌、胰腺癌等多种消化道上皮源性肿瘤的表达水平比相应正常组织明显升高,并且随访资料表明TROP2高表达组病人比低表达组病人预后差而且肿瘤切除后复发率和转移率也较高；体外实验也证明TROP2异常表达可以调控肿瘤细胞的生长、迁移、侵袭等生物学行为,另外TROP2在一些具有干细胞特性的前列腺基底细胞和肝脏卵圆细胞中也有表达,这意味着TROP2可能在前体细胞和肿瘤干细胞中也发挥着重要作用,因此TROP2也就成为近年来肿瘤领域研究的热点分子。虽然TROP2在某些消化道肿瘤的研究已有报道,但是TROP2在肝门部胆管癌的表达及其生物学作用还未见系统研究,进一步明确TROP2在肿瘤细胞内诱导的信号途径及其促进肿瘤生长的机制有可能为肝门部胆管癌的生物治疗提供有效的作用靶点。众所周知,肿瘤的生长和转移过程高度依赖于丰富的新生血管提供营养,而肿瘤的血管生成又受到多个信号途径的精密调控,由此学者提出了通过抑制肿瘤血管生成切断肿瘤营养供应来减缓肿瘤生长和进展的治疗方式,目前许多针对VEGFR等不同分子的抗血管生成药物已经进入临床应用。平均血管密度(MVD)是目前广泛应用于评价肿瘤血管生成的指标,临床研究表明MVD和肝外胆管癌病人的无病生存率和总体生存率密切相关,TACSTD家族另一成员EpCAM能够通过调控VEGF-A、HIF1的表达来调控肝细胞肝癌的血管生成,鉴于两分子在结构上有60%的相似性,TROP2在肿瘤中的生物学效应是不是和血管生成有关系呢?为了阐明TROP2在肝门部胆管癌生长中的作用及其分子机制,本课题进行了以下3部分的研究：(1)免疫组化和免疫印迹检测TROP2在肝门部胆管癌临床标本及相关细胞系中的表达水平,探讨TROP2和肝门部胆管癌各个临床病理特征的相关性,并评价TROP2对肝门部胆管癌病人的预后意义；(2)包装TROP2靶向沉默慢病毒颗粒并筛选TROP2稳定沉默的胆管癌细胞株,体外实验检测TROP2对细胞增殖、细胞克隆形成和肿瘤干细胞自我更新等生物学行为的影响；结合体内实验进一步探寻TROP2在对肿瘤生长和血管生成的作用；然后用不同的胆管癌细胞条件培养基刺激人脐静脉内皮细胞(HUVEC),进一步验证TROP2对肿瘤血管生成的作用；(3)结合文献资料,探寻TROP2在肝门部胆管癌细胞内诱导的下游信号途径,体外实验验证TROP2诱导的wnt/β-catenin途径活化对细胞增殖、细胞克隆形成和促血管生成因子VEGF的影响,从而明确TROP2促进肝门部胆管癌生长和血管生成的信号机制。第一部分TROP2蛋白在肝门部胆管癌中的表达及其预后意义目的检测TROP2在正常胆管和肝门部胆管癌组织中的蛋白和RNA水平,探讨TROP2与患者临床病理特征的相关性及其预后意义。方法收集山东大学齐鲁医院近10年行根治性切除(RO)的70例肝门部胆管癌患者的组织标本和部分正常胆管组织标本,应用免疫组化和实时定量PCR(Real-time PCR)检测TROP2蛋白和RNA水平并统计病人的临床资料；免疫印迹和实时定量PCR检测TROP2在常见肝门部胆管癌细胞株的表达水平。应用Fisher’s test分析TROP2水平和各个临床病理特征的相关性,Kaplan-Meier法绘制患者的生存曲线,Cox多因素比例回归模型来评价各个指标的预后意义。结果免疫组化显示肝门部胆管癌患者肿瘤标本内TROP2高表达率为61.4%,远高于相应正常胆管组织；Real-time PCR也表明肿瘤组织的TROP2RNA水平明显高于正常胆管组织(P=O.001)。免疫印迹显示TROP2在QBC919.FRH0201和HBDC三个常见肝门部胆管癌细胞株中均有不同程度表达,其中HBDC表达水平最高。Fisher’s test相关性分析显示TROP2与肝门部胆管癌组织分化程度(P=0.016)以及肿瘤T分期(P=0.031)明显相关,但是与患者性别、年龄、肿瘤大小、Bismuth-Corlette分型均无明显相关性。生存分析显示TROP2高表达组病人预后和生存率明显比TROP2低表达组差(30vs.68.5%P=0.001)。Cox多因素比例回归模型分析显示TROP2是肝门部胆管癌病人的独立预后因子。结论TROP2在肝门部胆管癌组织中高表达,并且与肿瘤分化程度(P=0.016)以及T分期(P=0.031)明显相关,TROP2蛋白水平可作为评价肝门部胆管癌病人预后的独立因子(P=0.004)。第二部分TROP2蛋白与肝门部胆管癌细胞增殖、克隆形成等生物学行为及肿瘤血管生成的功能性研究目的探讨TROP2对肝门部胆管癌细胞增殖、自我更新等生物学行为及肿瘤新生血管的作用方法构建TROP2靶向沉默慢病毒质粒,用HEK293T细胞包装慢病毒颗粒,适时感染胆管癌细胞株,筛选稳定TROP2沉默HBDC细胞株,待细胞转染稳定后检测TROP2对细胞增殖、细胞克隆形成以及肿瘤干细胞自我更新过程的影响。收集对照和TROP2沉默的HBDC无血清培养基用来培养HUVEC,24h后观察TROP2对HUVEC在基质胶上成管能力的影响。选取6-8周裸鼠,皮下注射2×106的对照组和TROP2稳定沉默HBDC细胞后监测肿瘤生长；回顾性检测病人肝门部胆管癌组织标本的微血管内皮细胞同时以MVD计数,Chi-square and Fisher’s exact检验分析肝门部胆管癌组织TROP2和MVD的相关性。结果慢病毒介导的TROP2沉默效果良好,能得到TROP2稳定沉默HBDC肝门部胆管癌细胞株。MTS实验显示TROP2能促进细胞增殖(P<0.01)；平板克隆形成实验表明TROP2蛋白沉默能降低细胞的克隆形成能力(P<0.001)；细胞球形成实验表明TROP2蛋白沉默后HBDC细胞形成细胞球的数目明显降低(P<0.01)。血管内皮细胞成管实验表明和对照组细胞相比,TROP2沉默组细胞的无血清培养基促进内皮细胞成管能力明显降低,并且具有统计学意义。体内实验结果表明TROP2能显著促进肿瘤的生长,70例肝门部胆管癌病人标本MVD为4-71, TROP2高表达组织MVD明显高于TROP2低表达组,Chi-square和Fisher’s exact检验显示临床标本中TROP2和MVD显著相关。结论TROP2沉默能显著降低肝门部胆管癌细胞的增殖,克隆形成和自我更新能力；动物实验和内皮细胞体外成管实验表明TROP2沉默能显著抑制肿瘤生长并且和肿瘤血管生成显著相关。第三部分TROP2通过增加β-catenin/TCF转录活性促进肝门部胆管癌生长和血管生成目的探寻TROP2促进肝门部胆管癌生长和肿瘤血管生成的信号途径。方法收集对照组和TROP2稳定沉默的HBDC胆管癌细胞株总蛋白和细胞核蛋白,免疫印迹检测细胞内和细胞核内β-catenin的蛋白水平；TOP/FOP荧光素酶报告系统验证TROP2对β-catenin/TCF转录活性的影响。ELISA和实时定量分别检测TROP2稳定沉默细胞内VEGF等促血管生成因子的水平；构建pCDH-β-catenin慢病毒包装质粒,用TROP2沉默HBDC细胞株继续筛选β-catenin过表达细胞株,进一步检测wnt/β-catenin信号途径对肝门部胆管癌细胞增殖和细胞球形成的影响,明确β-catenin在TROP2蛋白调控肝门部胆管癌生长和血管生成中的作用。结果免疫印迹结果显示TROP2沉默后细胞内β-catenin未见变化,但是细胞核β-catenin水平明显降低；TOP/FOP荧光素酶报告实验显示TROP2蛋白沉默能显著降低β-catenin/TCF的转录活性(P<0.01)。ELISA显示细胞培养基中的VEGF水平明显降低,并且具有统计学意义(P<0.05)。突变型β-catenin (S37A)转染入TROP2稳定沉默细胞HBDC后,ELISA显示细胞培养基内VEGF水平有所升高,细胞增殖、自我更新能力及促进内皮细胞成管功能得到一定程度的恢复。结论TROP2通过激活wnt/β-catenin信号途径促进VEGF的转录,从而促进肿瘤的生长和血管生成,为肝门部胆管癌的靶向治疗提供了新的方向。