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肿瘤细胞侵袭转移必须突破细胞外基质并穿过基底膜进入血液循环，这一过程的关键是降解细胞外基质中的不同构成成分，这些成分包括：胶原纤维、层粘连蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白糖苷。肿瘤细胞能够顺序释放各种降解酶来完成转移，例如：金属蛋白激酶，丝氨酸蛋白酶和内切糖苷酶等。在这些酶中，β-内切葡糖苷酸酶(即乙酰肝素酶)能降解硫酸乙酰肝素蛋白糖苷上的乙酰肝素侧链，是肿瘤转移和血管生成的重要调控因子。近期基因克隆研究显示，乙酰肝素酶为单一基因序列，未见亚型存在，所以它可能作为抗肿瘤转移药物的理想靶点。因此研究调控乙酰肝素酶表达的分子机制有重要意义。 真核始动因子4E(Eukaryotic Initiation Factor 4E,eIF-4E)是分子量为25kDa的mRNA帽结合磷蛋白，是eIF-4F复合体调控mRNA帽依赖性翻译的限速因子。已经发现人类肿瘤组织和细胞株中eIF-4E表达水平普遍升高，高表达的eIF-4E是调节恶性相关分子过量表达的中心环节。这些恶性相关分子有：ODC、c-myc、cyclin D1、VEGF和MMP-9等，它们过量表达导致肿瘤恶性表型的产生，并协同促进转移进程。但是eIF-4E调解基因表达的环节较复杂，由于eIF-4E连接mRNA的帽子结构，所以它可能在翻译起始、mRNA剪接、mRNA 3’端加工、mRNA的核浆转运和保护mRNA 5’端不受核酸外切酶的降解等步骤调解基因的表达水平。本实验研究目的：①观察选择性阻抑eIF-4E是否导致乙酰肝素酶在酶活性和蛋白表达水平上发生改变，从而确定eIF-4E是否参与大肠癌LS-174T细胞中乙酰肝素酶在帽依赖性翻译水平上的调控；②确定肿瘤细胞中高表达的eIF-4E是否参与乙酰肝素酶mRNA核浆转运，探讨eIF-4E在乙酰肝素酶转录后水平调控中的作用；③探讨阻抑eIF-4E是否促进了大肠癌细胞中乙酞肝素酶mRNA的降解并继发对乙酞肝素酶蛋白表达产生影晰 一、阻抑eIF闷E表达对乙酞肝素酶表达及酶活性的影响为了丹dF一4E表达，针对eIF一4E mRNA翻译起始区的反义寡核昔酸经脂质仁染大肠癌细胞，这种反义寡核昔酸含20个残基，并经硫代磷酸化修七实验结果显示，此序列的反义寡核营酸转染细胞后，半定量RT一PCR丈检测eIF一4E基因表达明显受到抑制;westembl。衍ng显示其蛋白表达户也显著下降，表明asODN具有较强的特异性，充分抑制了靶基因的表， eIF一4E被阻抑表达后，westembl流ing显示乙酞肝素酶蛋白在65K和soKDa的表达均下降(根据文献，65Kda代表乙酞肝素酶酶原而5价则代表激活的酶)，相应地乙酸肝素酶活力也显著下降。肿瘤细胞侵李的改变采用膜浸润培养系统检测，结果示:反义寡核普酸处理的e『阻滞组癌细胞侵袭力下降到约23%左右;而相对于未处理组的癌细胞，义寡核昔酸处理组癌细胞侵袭力无明显下降。研究表明乙酞肝素酌eIF一4E调控，阻抑eIF一4E可引起乙酞肝素酶蛋白表达和酶活性显著下并且继发导致肿瘤细胞侵袭力下降。 二、阻抑eIF一E对乙酞肝素酶mRNA核浆转运的影响基因表赵历很多步骤，包括:转录，mRNA的加工、核浆转运和降解，翻译及互的修饰等。有研究显示部分elF一4E定位于核小体内，并且选择性地封某些基因转录产物的核浆转运，所以eIF一4E可能对乙酸肝素酶基因牟后水平调控起关键作用。本研究表明随着eIF一4E被阻抑，Northem卜结果显示大部分乙酞肝素酶mRNA被滞留在细胞核内，且其蛋白翻谓达量。研究结果表明，阻滞dF一4E表达就阻滞了乙酞肝素酶mRNA庄浆转运过程，并进而降低其翻译表达效率。 三、阻抑eIF一E对大肠腺癌细胞乙酞肝素酶mRNA降解的调控究表明1llRNA的降解对基因表达的调控有重要影响，且m丑NA的降充翻译紧密关联，翻译起始因子eIF一4E可能在此过程中起关键作用。才验eIF一4E基因表达被抑制后，Northem blot和半定量RT一PCR结果显才酞肝素酶mRNA表达水平显著下降，且其蛋白翻译表达量也降低。纤表明:在LS一174T肿瘤细胞中阻抑eIF一4E显著降低了乙酞肝素酶mR’稳定性，并促其降解，进而影响乙酞肝素酶翻译表达和酶活性水平。 综合上述，本研究提示人大肠腺癌细胞中乙酞肝素酶受eIF4E调: 一2-阻抑eIF一4E可以显著地降低乙酞肝素酶的表达和酶活性水平，同时肿瘤细胞的侵袭力也有明显降低。cIF一4E调控乙酞肝素酶的机制包括:①乙酞肝素酶首先可能在帽依赖性翻译水平上受dF一4E的正性调控;②阻抑dF一E表达就影响乙酞肝素酶mRNA的核浆转运，进而降低乙酞肝素酶的翻译效率;③eIF一4E表达水平和乙酞肝素酶mRNA降解之间的关系密切，阻抑eIF碑E表达可以显著降低乙酞肝素酶mRNA丰度。本研究首次证明eIF一4E参与大肠癌LS一174T细胞中乙酞肝素酶表达的调控，这种反义策略可能应用于临床和实验性抗肿瘤转移的基因治疗中。