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南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)引起的水稻黑条矮缩病严重影响我国南方水稻种植区和玉米种植区的生产。目前,已完成SRBSDV的全基因组测序,明确了SRBSDV生物学和分子生物学特性,初步解析了病毒的基因组结构和少数编码蛋白的功能。但对于病毒编码的多数蛋白的功能以及病毒的致病机制尚不清楚,特别是SRBSDV在植物细胞间转移的分子机制亟待研究。因此,本课题拟克隆SRBSDV安徽分离物编码非结构蛋白的4个基因,经系列分子鉴定,明确SRBSDV编码的运动蛋白(MP),并深入探究MP的作用机制。1 SRBSDV mp基因的鉴定克隆SRBSDV S5-2、S7-1、S7-2和S9-2 4个基因,分别插入pCAM2300,构建重组表达载体pCAM-S5-2-GFP、pCAM-S7-1-GFP、pCAM-S7-2-GFP和pCAM-S9-2-GFP。分别插入pBin438,构建重组表达载体pBin-S5-2、pBin-S7-1、pBin-S7-2和pBin-S9-2。(1)MP蛋白在烟草表皮细胞中的定位pCAM-S5-2-GFP、pCAM-S7-1-GF P、pCAM-S7-2-GFP和pCAM-S9-2-GFP分别浸润本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片。未质壁分离的细胞,荧光在细胞壁均匀分布;发生质壁分离的细胞,pCAM-S7-1-GFP产生的荧光在细胞壁上呈不连续点状分布,其他3个处理的荧光不定位于细胞壁上或在细胞壁上不呈点状分布。(2)MP蛋白在细胞间的运动含有pCAM-S5-2-GFP、pCAM-S7-1-GFP、pCAM-S7-2-GFP和pCAM-S9-2-GFP的农杆菌稀释后分别浸润本氏烟叶片,pCAM-S7-1-GFP能在本氏烟细胞间自主运动并扩散到周围邻近细胞,而pCAM-S5-2-GFP、pCAM-S7-2-GFP和pCAM-S9-2-GFP均定位于单个细胞,不能向邻近细胞扩散。(3)MP蛋白与PVX(△P25)-GFP的功能互补pBin-S5-2、pBin-S7-1、pBin-S7-2和pBin-S9-2分别与运动缺陷型载体PVX(△P25)-GFP共浸润本氏烟叶片。pBin-S7-1能够互补PVX(△P25)-GFP在本氏烟细胞间的运动,而pBin-S5-2、pBin-S7-2和pBin-S9-2均不能互补PVX(△P25)-GFP在本氏烟细胞间的运动。因此,鉴定S7-1可能编码SRBSDV的MP蛋白。2 SRBSDV S7-1表达蛋白的自身互作及其与CP蛋白的互作克隆SRBSDV S7-1和S10基因,分别插入pCV-cYFP和pCV-nYFP构建重组表达载体pCV-S7-1-cYFP、pCV-S7-1-nYFP、pCV-S10-cYFP和pCV-S10-nYFP。分别插入pGADT7和pGBKT7构建重组表达载体pGAD-S7-1、pGBK-S7-1、pGAD-S10和pGBK-S10。(1)双分子荧光互补(BIFC)验证SRBSDV S7-1表达蛋白的自身互作及其与CP蛋白的互作pCV-S7-1-nYFP与pCV-S7-1-cYFP、pCV-S7-1-nYFP与pCV-S10-cYFP及pCV-S7-1-cYFP与pCV-S10-nYFP分别共浸润本氏烟。结果发现,SRBSDV S7-1表达的蛋白能自身互作,有明显的黄色荧光出现,而与CP蛋白不能互作,无黄色荧光。(2)酵母双杂交(Y2H)验证SRBSDV S7-1表达蛋白的自身互作及其与CP蛋白的互作pGAD-S7-1与pGBK-S7-1、pGBK-S7-1与pGAD-S10及pGAD-S7-1与pGBK-S10分别共转化酵母,结果发现,仅pGAD-S7-1与pGBK-S7-1共转化酵母能长出白色酵母菌落,说明SRBSDV S7-1表达蛋白能够自身互作,而与CP蛋白不能互作。3 SRBSDV S7-1基因的原核表达和纯化克隆SRBSDV S7-1基因,构建到原核表达载体pET-GST上,获得重组表达载体pET-S7-1。pET-S7-1转化大肠杆菌,经IPTG诱导与Ni+-NTA亲和柱纯化,获得分子质量约为68 kD的融合蛋白。Western blot分析显示,GST单抗能够与纯化的融合蛋白发生特异性反应,表明本研究成功得到S7-1标签蛋白,为深入研究S7-1基因的功能奠定了基础。