β-甘露聚糖酶在里氏木霉中的高效表达

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甘露聚糖是植物细胞壁的主要成分之一,广泛存在于多种植物组织中。β-甘露聚糖酶是主要的甘露聚糖降解酶,已经在动物饲料、食品、生物精炼、纺织、洗涤以及造纸等多种行业得到了应用。因此,提高β-甘露聚糖酶产量,降低β-甘露聚糖酶生产成本具有重大应用价值和现实意义。里氏木霉等丝状真菌具有高效合成分泌纤维素酶和半纤维素酶的能力,在β-甘露聚糖酶的生产中具有较好的应用前景。高效启动子是异源蛋白表达的关键元件。筛选、改造高效启动子是实现目标蛋白高效表达的重要策略。在本论文中,我们选择来源于草酸青霉的β-甘露聚糖酶Man5A,对其在里氏木霉中的高效表达策略进行了研究:(1)使用组成型启动子Pcdna1实现了 Man5A在葡萄糖培养基中的表达。构建了Pcdna1启动的man5A表达盒,随机插入到里氏木霉菌株QP4基因组中,获得的Qman菌株可产生纯度较高的Man5A。对所得到的Man5A的性质进行了初步研究,发现其在pH2.5-5.5的范围内均能保持较高的活性。Man5A最适反应温度在80℃,差示扫描量热法测得的熔解温度为80℃。对影响Pcdna1启动效率的关键序列进行了鉴定,在Pcdna1序列由原本的1159 bp缩短至831bp时,启动效率降为原来的81%,缩短至505 bp时启动效率明显降低,仅为原来的10%。此外,探究了含有Man5A的里氏木霉纤维素酶粗酶液与草酸青霉生产的富含α-半乳糖苷酶的纤维素酶粗酶液复配时在豆粕降解中的应用效果,发现当两者比例相当时,豆粕降解产生的还原糖水平最高。(2)使用诱导型启动子Pcbh1实现了 Man5A在纤维素培养基中的高效表达,并通过启动子序列改造和转录激活因子改造进一步提高了其表达水平。通过序列截短以及替换、删除Pcbh1序列中转录因子结合位点,构建了 3种不同的Pcbh1突变体。通过测定Man5A的表达水平,发现对Pcbh1中转录因子XYR1结合位点进行替换得到的突变体Pcbh1-IR的启动效率提高至原来的2.5倍。在获得了 β-甘露聚糖酶多拷贝表达菌株的基础上,通过过表达XYR1A824V持续激活突变体基因,获得了在葡萄糖培养条件和纤维素诱导条件下β-甘露聚糖酶均能够高表达的菌株。
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