婴幼儿血管瘤是婴幼儿期最常见的良性肿瘤，发病率高达10~12％，男女比例1:3~5。血管瘤有其独特的自然病史：出生后或生后不久出现并迅速增大，经6月~1年增生期后进入消退期，至7~8岁90%可自然消退。血管瘤增生、消退的确切机制，目前还不完全清楚。大量研究显示，血管瘤的增生和消退可能是由于血管内皮细胞的增殖和凋亡失衡所造成的。但到目前为止，关于内皮细胞增殖和凋亡的分子机制亦尚不完全明确。Survivin是新近发现的、迄今为止最强的凋亡抑制因子，有研究表明及本课题前期研究发现 Survivin蛋白在增生期血管瘤组织中高表达，并且定位于内皮细胞；而在消退期血管瘤组织中低表达或不表达，且其有可能通过抑制Caspase-3活性以干扰内皮细胞凋亡，促进其增殖。若能干扰Survivin蛋白在血管内皮细胞中的表达有望控制内皮细胞增生，诱导其凋亡。本研究采用Survivin ASODN抑制靶基因表达的策略，采用脂质体介导的转染方法，将Survivin ASODN导入体外培养的增殖期血管瘤内皮细胞(vascular endothelial cell，VEC)，研究Survivin ASODN对靶细胞的影响以揭示Survivin基因在血管瘤增生和消退机制中的作用，探讨Survivin ASODN在治疗增殖期血管瘤中的意义，为进一步开展临床应用研究奠定基础。　　第一部分婴幼儿增生期血管瘤内皮细胞的培养和鉴定及生长状况的观察　　研究目的：探讨体外分离培养和纯化婴幼儿增生期血管瘤内皮细胞的方法，对体外培养的细胞进行内皮细胞性质鉴定并检测其纯度，初步观察所培养细胞的生物学特性。　　研究方法：收集蚌埠医学院第一附属医院整形外科手术切除的15例新鲜婴幼儿血管瘤（按Mulliken标准，组织病理结果均为增生期血管瘤），无菌条件下立即放置于含有M199培养液的培养管中，放置于4℃冰盒中保存，运至细胞培养室，采用组织块法进行细胞培养，细胞培养成功后，在相差显微镜下刮除非内皮细胞。内皮细胞铺满瓶底，并进行传代，同时运用反复贴壁法及酶消化法行数次纯化，取第4代内皮细胞运用免疫组化法对内皮细胞进行鉴定并检测内皮细胞纯度。对所培养细胞进行计数并绘制细胞生长曲线。　　研究结果：15例标本均成功培养出血管瘤内皮细胞，培养的内皮细胞形态为较规则的圆形、椭圆形或多角形，核居中，部分可见核分裂相及双核，细胞境界清晰，细胞融合后呈现内皮细胞特有“铺路石”特征。细胞免疫组化鉴定：第Ⅷ因子相关抗原、CD31、CD34均为阳性，证实为内皮细胞，检测纯度为CD34(+)数为68.35%士3.58%，所培养的细胞具有“管腔形成”现象。细胞计数绘制的第3代细胞生长曲线显示：细胞数量在接种后6~7天左右进入快速增殖期，第10天左右细胞数量达到最高值，此后细胞数量进入稳定期。第7代细胞生长曲线显示：细胞数量在接种后3~4天左右进入快速增殖期，约第6~7天左右细胞数量达到最高值，此后细胞数量进入稳定期。最多传至第9代，细胞出现皱缩、变圆、脱落，大部分细胞体积缩小，贴壁细胞数量减少，脱壁悬浮细胞增多，生长缓慢难以继续培养传代。　　研究结论：采用组织块法可以分离培养婴幼儿增生期血管瘤内皮细胞，培养的细胞经鉴定为内皮细胞，具有内皮细胞特有“铺路石”特征，而且还具有血管瘤内皮细胞特有的“管腔形成”现象。传代后细胞纯度较高，可以满足相关实验需要。　　第二部分婴幼儿增生期血管瘤内皮细胞 Survivin基因表达状况的研究　　研究目的：运用 RT-PCR、Western-blot法和免疫组化法检测所培养的婴幼儿增生期血管瘤内皮细胞Survivin mRNA、Survivin蛋白表达水平。　　研究方法：将传代的第4代增生期血管瘤内皮细胞接种至培养瓶，常规培养1周至80~90%融合后，用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA混合消化液消化细胞，离心(1200r/min，5min)收集细胞，并制作细胞爬片，通过 RT-PCR法、Western-blot法和免疫组化法检测血管瘤内皮细胞Survivin mRNA、Survivin蛋白表达水平。研究结果：RT-PCR检测显示Survivin mRNA片段大小为338bp，β-actin为600bp，与理论值相符，Survivin mRNA表达强度为0.778±0.040。Western-blot显示Survivin蛋白分子量大小为16.5KD，β-actin为42.0KD，与理论值相符。Survivin蛋白表达强度为0.820±0.026。免疫组化显示Survivin蛋白表达量为6.80±0.82分，呈强阳性表达。　　研究结论：Survivin基因在婴幼儿增生期血管瘤内皮细胞中有表达　　第三部分 Survivin反义寡核苷酸对婴幼儿增生期血管瘤内皮细胞影响的实验研究　　研究目的：1、研究Survivin ASODN转染后体外培养的婴幼儿增生期血管瘤内皮细胞中Survivin基因的表达及Caspase-3活性表达。　　2、初步探讨Survivin ASODN对婴幼儿增生期血管瘤内皮细胞诱导凋亡的机制。　　研究方法：针对Survivin mRNA翻译起始位点设计并合成反义寡核苷酸，通过脂质体介导转染体外培养的婴幼儿增生期血管瘤内皮细胞，采用 RT-PCR、Western-blot和免疫组织化学法检测转染后各组血管瘤内皮细胞Survivin mRNA、Survivin蛋白表达及Caspase-3活性表达。同时测定转染后各组细胞生长抑制率，研究Surivin反义寡核昔酸对血管瘤内皮细胞的生长抑制作用及诱导凋亡的作用机制。　　研究结果：1、随着Survivin ASODN浓度增加，Survivin mRNA的表达明显下调，其差异具有显著性，其中Survivin ASODN浓度为600nM、作用72h时 Survivin mRNA抑制率达80.38%±0.02%，效果最佳；随着Survivin ASODN浓度增加，细胞Survivin蛋白表达亦下降。　　2、 Caspase-3活性分析发现，Survivin ASODN-脂质体复合物分别作用于血管瘤内皮细胞24、48h、72h后，Caspase-3被不同程度的激活，Caspase-3蛋白表达量皆不同程度的上调，与各对照组比较差异均有显著性（p<0.05）。Survivin ASODN浓度为600nM、作用48h时对血管瘤内皮细胞Caspase-3蛋白的上调程度最大。　　3、 MTT实验结果显示：Survivin ASODN对婴幼儿血管瘤内皮细胞的生长抑制作用随浓度增大而增强。　　4、倒置相差显微镜观察显示：实验组转染ASODN后的血管瘤内皮细胞出现皱缩、变圆、脱落；大部分细胞体积缩小，贴壁细胞数量减少，脱壁悬浮细胞增多，生长缓慢。其中ASODN浓度为600nmol/L、作用72h时此种改变最显著。　　5、 HE染色显示：实验组转染 ASODN后的血管瘤内皮细胞多数变圆、变小，细胞核固缩、碎裂，核被染成深蓝色或蓝黑色；细胞膜皱褶、卷曲，符合细胞凋亡征象。各对照组细胞仍保持原有的生长形状，细胞核规整，染成均一蓝色，胞浆呈淡红色。　　研究结论：1、Survivin ASODN体外转染后可明显下调婴幼儿增生期血管瘤内皮细胞 Survivin蛋白、Survivin mRNA表达水平，并可以激活Caspase-3。　　2、Survivin ASODN可以抑制血管瘤内皮细胞增殖，可能通过激活Caspase-3诱导血管瘤内皮细胞凋亡。　　3、Survivin基因可能是控制婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖或凋亡的关键基因之一。