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黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)是一株典型的白腐真菌,该菌株不仅具有非特异性的降解能力,而且能够产生具有抗逆性的厚垣孢子。真菌一旦形成了厚垣孢子,就可以有较长的货架期。本文描述了一种P.chrysosporium厚垣孢子工业化生产的发酵工艺。同时,探究其形成机制,以期指导生产。本课题研究具体分为以下内容:(1)介绍采用发酵工艺中补料分批培养形式,通过对厚垣孢子诱导培养基(补料)营养成分和发酵条件的单因素实验,得到了适用于工业发酵P.chrysosporium产厚垣孢子的生产工艺。优化后的补料配方是诱导剂-a 3.8 g/L,七水合硫酸镁2.5 g/L,硫酸氨含量为3.0 g/L,葡萄糖含量为30.0 g/L、苯甲醇0.50 m L/L、磷酸二氢钾2.0 g/L、氯化钙0.50g/L、吐温80 0.50 mL/L、维生素B1 0.001 g/L、微量元素液70.0 m L/L。最佳培养条件是:将100 m L、pH 4.5的四倍浓缩补料接入已培养48 h菌丝的培养基中,在35℃、160 r/min条件下振荡培养3 d,菌丝球干重及孢子数量分别是3.97 g/L、2.687×109个/L。(2)将上述优化的条件,应用于50 L发酵罐,最优的生产条件是将菌丝培养36 h后补料,补料后60 h放罐,收获厚垣孢子。与摇瓶相比,整个发酵周期缩短了24 h,厚垣孢子数量为5.710×109个/L,最终得到300.0 g产品,还原糖仅剩0.18 g/L。利用湿室载片培养技术测产品的萌发率为72%。(3)通过对固体培养基及接种时菌的状态的筛选比较,采用等比例秸秆麦麸培养基,接种1.0 g菌丝球发酵一周可产生大量厚壁的大孢子细胞,形成的菌垫约厚2.5 mm,与空气接触面较光滑且形成少量分生孢子,余1.336 g秸秆麸皮,利用率达86.64%。该大孢子细胞的特征是细胞壁普遍较液体发酵的厚垣孢子厚,且直径较大,测得的最大直径约70μm,在直径为40μm的大孢子中,细胞壁厚约6.7μm。(4)应用荧光染色技术测厚垣孢子成分。细胞壁由薄外壁及厚内壁组成,增厚部分由含β-1,4-糖苷键的多糖组成。细胞内含大量的中性脂肪酸。在纤维素酶解实验中,20 mg等量的菌丝和厚垣孢子细胞壁经酶解,测得的终产物浓度分别为0.244 g/L和0.215g/L,即纤维素不是厚垣孢子增厚细胞壁的主要成分;在β-葡聚糖酶解实验中,20 mg等量的菌丝和厚垣孢子细胞壁经酶解,测得的终产物浓度分别为0.480 g/L和0.598 g/L,即厚垣孢子葡聚糖含量较高;在几丁质酶解实验中,5 mg等量的菌丝和厚垣孢子细胞壁经酶解,测得的终产物浓度分别为0.313 g/L和0.290 g/L,即两者含量无明显差异。(5)锁定三条主要的显著富集的代谢通路—淀粉和蔗糖代谢通路、MAPK代谢通路及脂肪酸降解通路,并推导出P.chrysosporium的葡聚糖合成路径、脂肪酸代谢路径及MAPK调控路径,推测厚垣孢子增厚的细胞壁成分可能与葡聚糖有关,细胞内合成同时积累脂肪酸,为维持正常生长提供能量。选取六个相关的基因进行qRT-PCR验证,从整体上看此次转录组测序结果比较可信。