基于Nrf2/HO-1信号通路探讨天麻素对谷氨酸诱导的HT-22细胞铁死亡的保护作用

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神经退行性疾病(Neurodegenerative disease,ND)是以特异性神经元退行性病变或大量神经元丢失为主要特征的复杂神经系统疾病。其包括阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿氏舞蹈病和肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)等。天麻素是兰科草本植物天麻的干燥根块提取,其在神经退行性疾病中具有较强的抗氧化活性。谷氨酸过量产生的氧化性毒性与铁死亡机制相似,这种氧化性毒性与神经退行性疾病相关联,也是神经细胞发生死亡的重要机理之一。铁死亡是近几年来新认识的一种调节细胞死亡的形式,其与典型的细胞死亡形式(如:凋亡、自噬、坏死、焦亡)不同,由铁依赖性脂质过氧化堆积为特征。铁死亡在发生、发展进程中活性氧(ROS)的异常增多造成了细胞内的氧化还原的平衡失调。本课题拟建立谷氨酸诱导HT-22细胞损伤的模型,进一步研究天麻素对神经细胞保护作用及铁死亡发生的相关机制,为治疗神经退行疾病在临床上提供新的治疗策略和方法。目的:研究天麻素对谷氨酸诱导HT-22细胞铁死亡的保护作用,并进一步研究其内在的保护作用机制。方法:通过检测细胞活力,筛选谷氨酸和天麻素作用于HT-22细胞的不同时间和浓度,确定天麻素和谷氨酸的最佳处理时间和浓度;酶标法试剂盒检测HT-22细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出率;透射电子显微镜和倒置显微镜观察HT-22细胞形态的变化;MTT法检测不同细胞死亡抑制剂如Z-VAD-fmk(凋亡抑制剂)、Necrostatin-1(坏死抑制剂)、3-Methyladenine(自噬抑制剂)、Ferrostatin-1(铁死亡抑制剂)和DFO(铁离子螯合剂),来观察天麻素预保护细胞后对谷氨酸神经损伤模型HT-22细胞中活力的影响;WST-1法检测HT-22细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活力变化;硫代巴比妥酸法(TBA)检测HT-22细胞中丙二醛(MDA)的水平变化;紫外比色法检测HT-22细胞中谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的活性;流式细胞术检测线粒体膜电位(△Ψm)的变化和细胞内活性氧(ROS)水平;激光共聚焦荧光显微镜观察Nrf2的核转位;ICP-MS法检测细胞中Fe2+的含量变化;Nrf2抑制剂ML385处理后相关指标的变化;Western blot法检测Nrf2、HO-1、GPX4、Ferroportin 1、ACSL4、Ptgs2、Lamin B1、β-actin蛋白表达的变化以及沉默后Nrf2蛋白的表达;RT-qPCR法检测Nrf2、HO-1、GPX4 m RNA水平的变化;结果:1.天麻素对谷氨酸诱导的HT-22细胞损伤的抑制作用(1)MTT法实验结果显示,5 mM谷氨酸对HT-22细胞处理24 h后,细胞生长抑制率接近50%;而1-25μM天麻素预处理后可浓度依赖性的升高谷氨酸对细胞存活率的抑制作用;(2)微量酶标仪法实验结果显示,与正常对照组相比,5 m M谷氨酸作用于HT-22细胞LDH漏出率显著增加(P<0.01);而天麻素预保护HT-22细胞后LDH漏出率比谷氨酸模型组显著降低(P<0.01),并呈现浓度依赖性;(3)透射电子显微镜观察结果显示,与正常对照组相比,5 m M谷氨酸模型组,HT-22细胞线粒体脊梁密度增厚、变小;而天麻素预先保护HT-22细胞后,细胞线粒体形态趋于正常形态;(4)选用Fer-1(铁死亡抑制剂)、3-MA(自噬抑制剂)、Nec-1(坏死抑制剂)、Z-VAD-fmk(凋亡抑制剂)和DFO(铁螯合剂)5种抑制剂,MTT法实验结果提示1-25μM天麻素预处理HT-22细胞后作用于5 m M谷氨酸,Fer-1、DFO可在一定浓度范围内降低谷氨酸对细胞的抑制率(P<0.01),而Z-VAD-fmk(凋亡抑制剂)、3-MA(自噬抑制剂)和Nec-1(坏死抑制剂)产生作用不明显(P>0.05);(5)C11-BODIPY和H2DCF-DA实验表明,5 mM谷氨酸模型组与天麻素给药组相比,天麻素给药组可抑制谷氨酸诱导的HT-22细胞内脂质ROS和胞质ROS的升高(P<0.01);(6)JC-1荧光染色发现谷氨酸诱导线粒体膜电位的降低,与谷氨酸组相比,天麻素呈浓度依赖性抑制谷氨酸诱导HT-22细胞的线粒体膜电位的降低(P<0.01);(7)ICP-MS法检测结果显示,与谷氨酸组相比,天麻素给药组可抑制谷氨酸诱导的HT-22细胞铁离子含量的增加(P<0.01);2.通过Nrf2/HO-1信号通路探讨天麻素抑制谷氨酸诱导的HT-22细胞损伤作用(1)免疫荧光法观察Nrf2核转位,实验结果表示天麻素可以促进Nrf2入核;(2)Western blot法结果表示,天麻素随时间和浓度依赖应上调细胞核内Nrf2蛋白的表达;(3)MTT法结果显示,Nrf2抑制剂ML385处理后,天麻素对谷氨酸诱导的HT-22细胞的保护作用被抑制;(4)Western blot法结果显示,天麻素作用于HT-22细胞中Nrf2、HO-1、GPX4、Ferroportin 1蛋白表达量,比谷氨酸模型组表达量高(P<0.01);而天麻素作用于HT-22细胞中ACSL4、Ptgs2蛋白表达量,比谷氨酸模型组表达量低(P<0.01);(5)荧光定量PCR法结果显示,与谷氨酸模型组相比,天麻素给药组中GPX4m RNA表达上升(P<0.01),而Ptgs2 m RNA表达却降低(P<0.01),有显著性差异;(6)Western blot法结果显示,与正常组比,天麻素药物组作用于HT-22细胞中si Nrf2蛋白表达被抑制,具有显著性差异(P<0.01);结论:天麻素可以通过Nrf2/HO-1信号通路抑制谷氨酸诱导HT-22细胞铁死亡发生,发挥对神经退行性疾病的神经保护作用。
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