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研究背景:胃癌目前的流行病学现状仍不乐观,而浸润与转移是其发生进展的根源,并最终导致患者的不良结局。血管生成过程参与肿瘤发生发展的各个环节,特别与肿瘤的浸润、转移过程息息相关。目前临床上针对胃癌患者的抗血管治疗疗效不佳,探寻新的抗血管治疗靶点是十分必要的。外泌体是一种具有生物活性的囊泡,其在循环中的半衰期较长,稳定性高,可为肿瘤分泌的生物活性物质提供较为安全的环境并可供检测,是介导肿瘤细胞与肿瘤基质细胞间的交流的重要载体。微小核糖核酸microRNA是在转录后水平负向调控基因表达的重要物质。既往的研究以及本课题组前期实验结果证实,c-MYB作为转录因子与肿瘤血管生成过程密切相关。生物信息学证实,miR-130a在c-MYB的mRNA的3’端非编码区有特异性结合位点,此外有文献证实miR-130a在血管生成中同样发挥着重要功能。研究目的:本研究旨在进一步探索肿瘤血管生成的机制,证实胃癌来源外泌体中富集miR-130a,并转运进入血管内皮细胞中靶向c-MYB,从而促进血管生成。以期为胃癌的抗血管治疗提供新的靶点,及为肿瘤进展提供潜在的新的生物学检测指标。研究内容及方法:1、临床水平:① Kaplan-Meier plotter分析c-MYB蛋白表达差异对于胃癌患者生存的影响;②收集胃癌组织及其相对应的癌旁组织,检测比较癌及其相对应的癌旁组织中miR-130a及c-MYB的表达情况;2、细胞水平:①收集SGC7901细胞培养液,多步差速离心提取外泌体,并于电镜下观察其形态,Western blot检测其特异性分子标志;②生物信息学分析及荧光素酶报告基因验证miR-130a对c-MYB靶向作用。③培养SGC7901,通过转染使其降表达miR-130a,并获得相应miR-130a低表达的外泌体,不同miR-130a含量的胃癌外泌体与HUVEC细胞共培养后,进行HUVEC细胞功能学实验;Western blot及RT-qPCR分别检测c-MYB与miR-130a含量变化。④直接改变HUVEC细胞中miR-130a含量,采用lipo-2000商业化转染试剂直接转染血管内皮细胞使其过/降表达miR-130a,再进行血管细胞功能学试验;Western blot及RT-qPCR分别检测细胞内c-MYB与miR-130a含量变化。3、动物实验水平①过/降表达miR-130a荷瘤小鼠模型建立:慢病毒感染SGC7901细胞系获得SGC7901-miR-130a过/降表达细胞系,裸鼠皮下接种植瘤;②荷瘤小鼠成瘤期间监测:监测小鼠肿瘤大小的变化,验证miR-130a过表达荷瘤小鼠肿瘤生长迅速。③监测小鼠肿瘤中分子指标变化:外泌体抽提试剂盒提取小鼠血清外泌体,RT-PCR验证各组中miR-130a变化;检测小鼠移植瘤组织miR-130a及c-MYB表达,免疫组织化学染色CD31,用于检测各组移植瘤中血管生成情况。研究结果:1、临床水平:数据库资料显示随着随访时间延长高表达c-MYB胃癌患者生存率相对低表达c-MYB患者持续较高;临床组织样本证实了胃癌组织中的c-MYB蛋白含量较癌旁组织低;同时组织中c-MYB mRNA的表达没有明显差异,且胃癌组织中miR-130a高表达。2、体外水平:血管内皮细胞直接过/降表达c-MYB会引起血管细胞的增殖、迁移、成环功能改变,进而影响血管生成。生物信息学预测及荧光素酶报告基因验证,发现同样与血管生成密切相关的miR-130a在c-MYB mRNA的3’非编码区存在保守结合位点。提取预处理过的胃癌SGC7901细胞系外泌体,与血管细胞共孵育后发现,SGC7901外泌体中富集miR-130a,且此外泌体可通过靶向c-MYB促进血管细胞的增殖、迁移及成环能力。随后在血管细胞中直接过/降表达miR-130a,直接证明了miR-130a靶向c-MYB促进血管生成。3、体内水平:在小鼠成瘤期间观察发现,高表达miR-130a组的小鼠移植瘤增长最为迅速,而低表达miR-130a组小鼠移植瘤增殖最为缓慢。在高/低表达miR-130a组的小鼠血清外泌体及移植瘤组织中,miR-130a的含量依照植瘤细胞系的不同而相应的发生高/低表达,且移植瘤中的c-MYB蛋白含量相应的低/高表达。CD31免疫组织化学染色证实在高表达miR-130a组小鼠移植瘤中血管密度要高于低表达miR-130a组及阴性对照组。研究结论:1、胃癌细胞中高表达miR-130a,并可通过外泌体分泌到细胞外;2、胃癌外泌体中富集miR-130a,经转运进入血管细胞中可以通过靶向c-MYB而促进其增殖、迁移、成环能力,进而促进血管生成。3、体内实验证实,靶向减少胃癌外泌体中miR-130a,可以起到减少血管生成进而抑制肿瘤生长的作用,可作为潜在的治疗靶点。