猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是以感染猪只高热、咳嗽、脑脊髓炎和繁殖障碍为显著特征的急性、烈性传染病。得益于伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）灭活疫苗和弱毒疫苗的广泛使用以及PR净化方案在部分规模化养殖场的成功实施,2011年前,该病在我国仅有零星报道,且多为潜伏感染。但自2011年11月天津地区首次暴发新型PR以来,该病在我国超过20个省、市、自治区暴发,PR新型毒株的出现导致基于Bartha株或经典毒株的疫苗保护力下降,很多已接种PRV疫苗的规模化猪场也报道了该病的发生。随着测序技术的发展,PRV疫苗株、经典株、新型毒株基因序列的差异已被明晰,但导致不同PRV毒株间生物学特性差异的致病机理尚不明确,本课题旨在通过代谢组学研究方法,明确不同毒株潜在的致病差异和代谢特点,进而研究对新型毒株安全有效的新型疫苗。本课题主要研究内容如下:1.PRV感染导致细胞脂类代谢紊乱截止至2020年2月,NCBI数据库共收录31株PRV全基因组序列,基于该数据库,本研究构建了PRV全基因组ML进化树。结果显示包括Bartha株在内的12株国外分离毒株均在同一进化分支上。我国共分离得到19株PRV,属同一进化分支,我国的进化分支又可分为两个亚分支,包括EA株在内的4株PRV属同一亚分支,被认为是经典毒株;而2011年后所分离的毒株属同一亚分支,被认为是新型毒株。基于进化分析,本研究以疫苗毒株Bartha株、经典毒株Ea株和新型毒株HNX株为代表研究不同PRV毒株的代谢特点。并探究了Bartha株、EA株和HNX株感染肺泡巨噬细胞（iPAM）后的生长特性。利用液相色谱-质谱联用（LC-MS）和生物信息学技术对PRV疫苗毒株（Bartha）、经典毒株（EA）和新型毒株（HNX）感染iPAM细胞后的代谢物进行测定和分析,共鉴定3864种代谢物。较对照组,Bartha株感染组检测到246种差异代谢物,EA株感染组检测到225种差异代谢物,HNX株感染组检测到272种差异代谢物。3种毒株感染iPAM细胞后,脂类差异代谢物均占全部代谢差异物50%以上,其中作为细胞膜主要脂类的甘油磷脂变化最大,占全部差异物代谢27%以上。PRV作为囊膜病毒,其复制严格依赖宿主的膜系统,细胞膜的主要脂类,磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸在三株PRV感染中丰度显著降低,且HNX株感染降低的倍数最大。我们还发现PRV在感染过程中能诱导某些特定种类的具有相同碳链分子的丰度变化,提示不同PRV毒株感染对某些特定类型的具有相同碳链的分子的利用、调控具有偏好性。PRV感染过程中某些具有生物学功能的脂类分子丰度改变,例如鞘磷脂、神经酰胺、半乳糖基神经酰胺、葡糖基神经酰胺等。这些代谢物是天然免疫、炎症等生命活动的调节因子,HNX株能调控这类代谢物的丰度,为病毒复制提供有利条件。2.长链神经酰胺通过诱导巨噬细胞M1型极化抑制PRV复制代谢组学的结果揭示了PRV不同毒株感染的共同代谢规律,也发现了不同毒株特有的代谢特点,如长链神经酰胺在HNX株感染的iPAM细胞中丰度降低,但在EA株感染的iPAM细胞中显著升高。长链神经酰胺作为重要的生物活性代谢产物,其对PRV复制的影响和抗病毒免疫调节的具体机制尚不明晰。本课题以iPAM细胞为研究对象,给予不同浓度的C14-ceramide处理,通过RT-qPCR检测经典M1型极化标志基因（IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-12）的m RNA相对表达水平从而检测C14-ceramide的极化诱导作用。并通过Toll受体4（Toll-like receptor4,TLR4）的抑制剂Resatorvid和髓样分化因子（myeloiddifferentiation-factor88,MyD88）的siRNA,探究C14-ceramide在巨噬细胞诱导极化改变的信号通路。结果表明C14-ceramide通过TLR4-MyD88通路介导巨噬细胞M1型极化。本研究发现,C14-ceramide诱导的iPAM细胞M1型极化能显著的抑制Bartha株、EA株、HNX株在iPAM细胞中的复制,且C14-ceramide能诱导iPAM细胞表达Fms样酪氨酸激酶3配体（Flt3L）。3.Flt3L作为PRV疫苗分子佐剂的潜能C14-ceramide能诱导Flt3L的表达,已有研究证明Flt3L在抗病毒天然免疫中发挥了重要的调节重用,具有作为疫苗分子佐剂的潜能。本课题探究Flt3L作为PRV弱毒疫苗分子佐剂的可能性。本研究运用了CRISPR/Cas9和Cre/lox基因编辑技术,构建了HNX-TK-/g E--Flt3L重组毒,通过RT-qPCR、Western blot和间接免疫荧光（IFA）验证了Flt3L在HNX-TK-/g E--Flt3L感染细胞中的转录和表达。并在体外测定该重组毒的生长特性。研究表明HNX-TK-/g E--Flt3L与其亲本毒HNX株在体外的生长特性一致,且相较于传统的TK和g E双缺弱毒株,重组毒株的免疫原性显著增强,免疫小鼠的中和抗体、PRV-g B抗体和干扰素表达水平均显著提高。进一步研究发现HNX-TK-/g E--Flt3L重组毒在体外和体内均可以激活树突状细胞,小鼠攻毒保护试验证明,HNX-TK-/g E--Flt3L能表现出更好的保护效果。本研究证明了Flt3L作为PRV疫苗分子佐剂的潜能,构建的HNX-TK-/g E--Flt3L重组毒具有被开发成为安全高效的PRV疫苗的潜力。