研究背景神经胶质瘤约在成年人恶性原发性脑肿瘤占有75%的比例。胶质母细胞瘤(GBM,WHOⅣV级)的患者的平均生存期在诊断之后仅有14个月左右。目前,神经胶质瘤的治疗手段和策略主要包括外科手术切除、口服烷基化药剂和放射疗法等。尽管在针对神经胶质瘤的治疗干预方面,科学家们和临床医师们已经取得了很大的进步,但是目前为止的治疗策略仅显示出十分有限的患者生存期改善。因此,对神经胶质瘤生长和发展的潜在机制的深入探究对于开发该疾病新的治疗策略尤为重要。内质网是一个其形状和结构与发生在该细胞器内的生物学过程及其功能相关的特殊结构。它由相对复杂的膜系统组成,该系统产生核膜和外围内质网,后者由许多片状和管状结构组成。实际上,内质网的结构是动态的,可以对生理或病理刺激产生反应而适应细胞需求。在细胞发生应激反应时,错误折叠的蛋白质积聚在内质网中,因此内质网的功能障碍会引起未折叠蛋白反应(UPR)的激活,这种状态被称为内质网应激状态。多种内源性和外源性因素都可能会导致细胞状况的改变,从而影响内质网稳态及其正常功能。在应激状态下可能会发生一连串的信号通路改变以重建内质网稳态。在这些信号通路因素中,转录激活因子6(ATF6),蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)和肌醇需求酶-1(IRE1)的表达激活,是在内质网应激反应中启动UPR的三个主要跨膜蛋白途径。其在正常条件下,多处于非激活的状态,而在内质网应激条件下,则通过与UPR的主要调节蛋白GRP78结合蛋白(BIP)发生分离而激活。据报道,增强内质网应激可在GBM细胞中产生细胞毒性作用,这表明内质网应激可能在神经胶质瘤中起着重要作用。PLP2基因,也被称为A4/A4LSB等,该基因首先在结肠上皮细胞中发现。在目前研究中,该基因所编码的蛋白脂质蛋白2是定位于内质网的不可或缺的膜蛋白之一。近年来,有数篇研究报道蛋白脂质蛋白2参与了癌症细胞的生长、增殖和迁移等生物学过程,其中包括恶性皮肤黑色素瘤、乳腺癌和人成骨肉瘤等。有关该分子生物学功能的研究显示,PLP2敲除小鼠在缺氧条件下在神经元中显示出内质网应激过程的激活,从而导致凋亡性细胞死亡。同时有研究表明,蛋白脂质蛋白2似乎在正常的原肠胚形成的生物过程中扮有重要角色,但是目前为止关于PLP2基因及其编码蛋白的确切功能,尤其是其在胶质瘤中的可能作用机制尚不清楚。基于上述研究基础的现状总结,本研究通过公共数据库生物信息学分析以及临床胶质瘤手术病人标本收集切片后免疫组织化学染色、RNA干扰、透射电子显微镜拍照、EdU染色、CCK-8细胞活力测定、流式细胞学检测、Western blot蛋白印迹、慢病毒转染、裸鼠颅内原位种瘤等多种生物学实验方法,对蛋白脂质蛋白PLP2在胶质瘤中的角色以及潜在机制进行实验探究。研究发现,相比于低级别胶质瘤,高级别胶质瘤中的PLP2表达水平明显升高,并且PLP2高表达水平与该病的不良预后生存期存在统计学相关性。在机制方面,神经胶质瘤细胞系中PLP2的敲低诱导内质网应激的激活,进而导致细胞凋亡和自噬的增加。而在PLP2敲低的U87和U251胶质瘤细胞系中,应用自噬抑制剂氯喹(CQ)会进一步增加凋亡性细胞死亡。与此同时,体内原位U87-shPLP2和U251-shPLP2颅内原位移植种瘤模型显示,PLP2敲低可降低神经胶质瘤在动物体内的生长。因此,我们的研究表明,PLP2高表达在胶质母细胞瘤进展中具有重要作用,PLP2分子靶向治疗以及自噬抑制剂的联合应用可作为将来胶质瘤治疗策略的新兴研究方向之一。第一部分蛋白脂质蛋白PLP2在胶质瘤中的表达情况及其与肿瘤增殖和预后的关系研究目的1.明确蛋白脂质蛋白PLP2在胶质瘤整体中的表达水平分布。2.探究PLP2表达与肿瘤增殖及预后生存期的关系。研究方法1.检测三大公共数据库Rembrandt、癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)、中国胶质瘤基因组图谱(The Chinese Glioma Genome Atlas,CGGA)中PLP2mRNA水平的表达情况,并利用Kaplan-Meier法绘制PLP2高表达与低表达分组预后生存期分析的曲线。2.应用免疫组织化学染色实验方法检测不同病理级别临床胶质瘤患者组织标本中蛋白脂质蛋白PLP2的表达差异。3.应用Western blot免疫印迹实验方法检测人类正常胶质细胞细胞株NHA以及胶质母细胞瘤细胞株U87、A172、U251、T98中PLP2的表达丰度。4.应用RNA干扰技术敲减PLP2并通过Western blot实验检测敲除效率。5.利用细胞活力Cell counting kit-8(CCK-8)法、EdU荧光染色法检测PLP2敲减后对胶质母细胞瘤细胞系增殖的影响情况。研究结果1.PLP2高表达水平与神经胶质瘤的肿瘤高分级及患者不良预后生存期相关通过分析来自Rembrandt,TCGA和CGGA的网络公开数据库,我们发现与正常的脑组织中的表达相比,胶质瘤、尤其是恶性胶质母细胞瘤中的PLP2表达显著上调(P<0.001)。对收集的本单位72例石蜡包埋的神经胶质瘤组织切片样本(其中包括WHO级别Ⅱ级16例,Ⅲ级21例,Ⅳ级35例)以及5例正常的脑组织样本进行PLP2免疫组化染色的平均染色评分的定量分析结果表明,PLP2的表达随胶质瘤WHO等级分级的升高而呈增加趋势。此外,对正常人星形胶质细胞细胞系NHA和人胶质母细胞瘤细胞系U87、A172、U251和T98的Western blot分析结果显示,相比于NHA,肿瘤细胞系均显示出更高的PLP2表达水平。根据三个公开数据库中病人预后相关信息的Kaplan-Meier函数生存分析结果表明,高PLP2表达组与低PLP2表达组相比,患者总体生存期更短,差异具有统计学意义(Rembrandt P<0.0001,TCGA P<0.05,CGGA P<0.0001)。2.PLP2敲减能够抑制胶质瘤细胞系U87、U251细胞的增殖本研究使用了小分子干扰RNA(siPLP2)抑制U87和U251胶质瘤细胞系中PLP2的表达,Western blot结果表明了显著的敲低效果。CCK-8实验结果显示,使用siPLP2分别对U87和U251胶质瘤细胞系处理24h,48h,72h后可显著抑制两种细胞系中的细胞活力。EdU荧光染色分析进一步证实,用siPLP2对U87和U251处理48 h后具有增殖活性的胶质瘤细胞比例显著减少(P<0.001)。研究结论PLP2在神经胶质瘤中的表达水平与肿瘤级别呈现出相关性,同时高PLP2表达水平的胶质瘤患者具有更差的预后生存期,进一步的细胞生物学实验显示,siPLP2敲减PLP2表达后肿瘤细胞的增殖能力得以抑制。第二部分 敲减PLP2激活内质网应激反应并抑制体内胶质母细胞瘤生长研究目的1.探究PLP2敲减对胶质瘤细胞内质网应激反应的调节及机制。2.明确PLP2敲减对动物实验体内胶质母细胞瘤生长的影响。研究方法1.应用透射电镜(TEM)观察两组siRNA对PLP2敲减处理后胶质瘤细胞中内质网结构的变化。2.通过Western blot技术检测两组siRNA对PLP2敲减后内质网应激相关通路蛋白的表达变化情况。3.应用慢病毒感染技术构建PLP2稳定敲除的胶质母细胞瘤细胞系U87-shPLP2 和 U251-shPLP2。4.应用裸鼠颅内原位种瘤模型检测蛋白脂质蛋白PLP2敲减对动物实验体内胶质母细胞瘤生长的影响。5.应用HE染色、免疫组化染色对小鼠荷瘤情况及有关蛋白的表达情况进行检测。6.利用Kaplan-Meier函数生存分析法绘制分析不同组别小鼠的预后生存期曲线。研究结果1.蛋白脂质蛋白PLP2敲减激活了胶质瘤细胞中的内质网应激反应透射电镜图像显示,在U87和U251细胞系siRNA处理48h后siPLP2敲减处理组细胞与siNC处理组细胞相比,内质网发生明显变化,具体表现为内质网结构扩张膨胀甚至发生破碎。Western blot结果显示与siNC处理组细胞相比,通过siPLP2敲减处理的胶质瘤U87和U251细胞中内质网应激通路的标志性蛋白CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)和葡萄糖调节蛋白78(GRP78)表达显著升高,同时内质网应激有关信号通路的相关蛋白质磷酸化RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(p-PERK)、磷酸化肌醇需求酶1α(p-IRE1α)、磷酸化真核起始因子2α(p-eIF2α)的表达水平亦表现出显著上调。表明PLP2敲减在胶质瘤细胞中激活了内质网应激反应过程。2.蛋白脂质蛋白PLP2敲减在动物体内实验中抑制胶质母细胞瘤生长应用慢病毒shRNA设计构建了 PLP2稳定敲除的胶质母细胞瘤细胞系,对其敲除效率通过Western blot实验进行了验证,然后通过向裸鼠颅内植入U87-shNC细胞、U87-shPLP2细胞、U251-shNC细胞和U251-shPLP2细胞来建立原位肿瘤模型。HE染色结果表明对于U87和U251两组细胞系,PLP2敲除后的肿瘤体积较shNC对照组体积较小。基于实验结果的Kaplan-Meier函数的生存分析结果显示shPLP2处理组的总生存期显著延长(P<0.01,P<0.001)。免疫组化结果显示与shNC组相比,U87-shPLP2和U251-shPLP2原位肿瘤中的PLP2的表达显著下调,而与增殖效果相关的蛋白Ki-67表达明显降低,和细胞凋亡的发生相关的蛋白裂解半胱天冬酶3(cleaved-caspase3)表达明显升高。研究结论蛋白脂质蛋白PLP2敲减在胶质瘤细胞中激活内质网应激反应,并且在动物体内实验中对胶质母细胞瘤生长也有抑制作用。第三部分 胶质母细胞瘤中敲减PLP2调节内质网应激反应介导的凋亡和自噬研究目的1.明确PLP2敲减激活的内质网应激反应是否介导凋亡。2.明确PLP2敲减激活的内质网应激反应是否介导自噬。3.探究PLP2敲减所诱导的内质网应激反应介导的凋亡与自噬的相互作用。研究方法1.应用两个小干扰RNA序列siPLP2-1和siPLP2-2对U87和U251两个细胞系进行PLP2敲减处理。2.应用流式细胞学技术对不同处理条件下Annexin V/PI染色的胶质瘤细胞的凋亡发生情况进行检测。3.应用透射电镜(TEM)对PLP2敲减后胶质母细胞瘤细胞系中具有典型的双层膜结构的自噬小体的数目改变情况进行观察统计。4.通过Western blot实验对不同处理条件下与自噬和凋亡相关的部分蛋白的表达变化情况进行评估。5.应用自噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)预处理蛋白脂质蛋白PLP2敲减前胶质母细胞瘤细胞系,并通过Annexin V/PI染色针对抑制自噬对细胞凋亡发生情况的影响进行检测。研究结果1.PLP2敲减通过CHOP增加内质网应激反应介导的凋亡流式细胞学结果显示U87和U251的PLP2敲减都使得处于早期(Annexin V+/PI-)和晚期(Annexin V+/PI+)阶段的凋亡细胞比例增加。Western blot结果进一步证实,用siPLP2处理两种细胞系48小时后,凋亡相关的标志性蛋白裂解半胱天冬酶9(cleaved-caspase 9),裂解半胱天冬酶3(cleaved-caspase 3)和裂解多聚ADP核糖聚合酶(cleaved-PARP)表达水平均明显上调。进一步Western blot结果显示,使用siCHOP来抑制内质网应激的关键蛋白CHOP的表达后,PLP2敲低引起的凋亡效应可以部分被逆转,证明PLP2敲减引起的凋亡增加是由内质网应激所介导。2.PLP2敲减通过CHOP增加内质网应激反应介导的自噬透射电镜TEM结果表明与siNC处理组相比,siPLP2处理后的U87和U251细胞系中具有特征性双层膜结构的自噬小体数目显著增加(P<0.001)。与此同时,Western blot实验进一步评估了用siPLP2处理的U87和U251细胞中与自噬相关的经典蛋白标志物。结果证实,PLP2敲低导致ATG5蛋白表达水平增加,LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ蛋白表达水平的比例增加,而P62蛋白表达水平降低。这表明在siPLP2处理的细胞中自噬流增加。用siNC或siCHOP处理U87-shNC和U87-shPLP2细胞系48 h后,收集蛋白进行Western blot实验结果表明,在CHOP敲除的情况下,由shPLP2诱导的LC3BⅡ/LC3BI的表达比例水平降低了,同时由shPLP2诱导的p62表达水平的降低被增强。上述结果进一步证实了 PLP2敲低诱导的自噬是由内质网应激所介导。总结来说,在神经胶质瘤细胞中,PLP2的敲减还通过内质网应激诱导的CHOP调节增加了细胞自噬水平。3.应用自噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)预处理可增加胶质瘤细胞中PLP2敲减通过内质网应激介导的调亡效应使用氯喹(CQ)在药理上对自噬进行抑制时,在10 μM氯喹(CQ)预处理1小时的条件下,通过流式细胞术检测到,使用CQ处理增加了 U87和U251细胞中PLP2敲低所诱导的细胞凋亡。统计分析的结果表明,与siPLP2组相比,siPLP2+CQ组的凋亡细胞数目百分比显著增多(P<0.01)。与这些数据一致,Western blot结果表明,与siPLP2处理的细胞相比,siPLP2/CQ处理的细胞中cleaved-PARP的蛋白表达水平也有所增加。实验结果证实,抑制自噬作用会增加由蛋白脂质蛋白PLP2敲低诱导的凋亡性细胞死亡。研究结论PLP2敲减在胶质母细胞瘤细胞系中对内质网应激反应介导的凋亡和自噬进行调节。应用自噬抑制剂预处理可增加调亡效应,联用自噬抑制剂可增强PLP2敲减对胶质母细胞瘤的抑制作用。