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目的：准分子激光原位角膜磨镶术(Laser-assisted in situkeratomileusis, LASIK)是一种安全有效的矫正角膜屈光不正的手术方式。但是，由于手术过程中角膜神经丛的离断和损伤，术后大部分患者出现了不同程度的干眼，严重影响患者的视觉质量和生活质量，是屈光手术发展过程中亟待解决的问题。本论文致力于通过结合纳米材料的特殊性能与电刺激技术，构建高效的眼用电刺激纳米电极，以促进受损伤的神经细胞的快速修复与再生，解决屈光手术发展所产生的严重副作用问题。本研究通过开发高电化学活性的聚苯胺化石墨烯纳米电极，有效解决电刺激技术在临床应用中长期存在的瓶颈，即缺乏高电化学电容性能的稳定电极。我们进一步基于纳米材料组装可佩戴式的眼用电极，用于刺激修复角膜神经丛损伤，检测其对角膜神经轴突的修复作用及可能的作用机理，为临床LASIK术后角膜神经的修复提供新的技术方法。此外，我们进一步考察了基于聚苯胺化石墨烯的电刺激对于PC12细胞生长的影响，期望进一步扩展本论文所开发的纳米电极材料和相关电刺激技术在临床神经修复上的应用范围，为多种神经元损伤凋亡性疾病的治疗提供新的思路。
方法：首先，我们采用本课题组自主发明的简便、环保的聚合增强球磨法对石墨粉和苯胺单体进行球磨加工，一步法得到聚苯胺化石墨烯复合材料(Polyaniline functionalized graphene,PANI-G)。采用原子力显微镜、拉曼光谱和红外光谱对所制备的PANI-G的理化性能进行表征，并通过CCK-8法和循环伏安法对PANI-G的生物性能和电化学性能进行检测。然后，从兔角膜神经来源的三叉神经节分离培养三叉神经元细胞，通过细胞形态和免疫荧光染色法对得到的细胞进行鉴定后，将其接种到PANI-G材料制备的膜电极上。在细胞粘附的PANI-G电极上施加电场进行电刺激，以细胞形态、轴突长度和细胞数量作为评价神经修复情况的指标。其后，用荧光钙离子探针对三叉神经元细胞内钙离子含量进行检测，由Westernblot检测钙离子相关信号通路及MAPK信号通路相关蛋白的表达量。通过比较电刺激组和对照组之间的差异，探讨电刺激促进神经修复的作用机制。我们进一步进行了动物实验以确定电刺激的修复作用。选用新西兰大白兔制作LASIK兔眼模型，模拟角膜神经丛的损伤。采用PANI-G材料制作的眼用纳米电极对术后兔眼进行电刺激，裂隙灯观察一般临床情况，用角膜共聚焦显微镜拍摄兔眼中央角膜上皮下及浅基质神经图像，并使用NeuronJ软件对所得图像进行处理，计算神经密度，作为电刺激角膜神经修复动物实验的评价指标。同时，实验兔电刺激后用裂隙灯显微镜、眼底照相机及光学相干断层扫描技术(Optical coherencetomography, OCT)对眼表和眼底情况进行观察，以评估眼用电极和电刺激参数对眼部的副作用。此外，为进一步扩展PANI-G纳米电极及电刺激技术的应用，我们选用PC12细胞作为神经模型细胞，将其接种到PANI-G膜电极上，施加电场进行电刺激，考察轴突长度和细胞数量的变化以评价神经的修复情况，并通过细胞划痕实验探讨电刺激对神经细胞定向迁移能力的影响。
结果：我们通过球磨苯胺单体和石墨粉混合物成功制备了PANI-G纳米材料，原子力显微镜结果显示其具有纳米片层状结构，厚度约为1.7nm。拉曼光谱结果显示其同时具有聚苯胺和石墨烯的特征峰，红外光谱结果显示其具有聚苯胺的特征峰，证明聚苯胺化石墨烯的成功合成。CCK-8的结果表明所合成的PANI-G在40μg/mL以下的浓度和细胞共培养72小时，细胞存活率超过80%。证实所制备的PANI-G纳米材料无细胞毒性，生物相容性良好。电化学循环伏安(CV)曲线结果发现，PANI-G的电化学活性比单纯机械球磨处理后的石墨粉提高很多。细胞形态学和神经元细胞的特异性蛋白(如β-tubulinⅢ、GAP43和NF200)的免疫荧光鉴定结果证实，我们成功从幼兔三叉神经节中分离提取到三叉神经元细胞。经过多次实验与条件摸索，我们确定在PANI-G膜电极上应用电刺激的条件为：以±500mV/cm的电场强度的低频双相脉冲电压，每天1小时的持续刺激时间，重复刺激5天后效果最佳。在最优电刺激条件下，三叉神经元细胞的轴突长度由对照组的53.25μm增长为电刺激后的84.24μm(P＜0.001)，神经元细胞的轴突长度显著增长了58%。此外，培养7天后的对照组的三叉神经元细胞呈衰老状态，细胞突起之间的网络连接变稀疏，而轴突长度减短为50.89μm。但是对于相同条件下进行连续7天电刺激的实验组，其细胞形态仍然保持神经元细胞典型的长轴突状态，轴突长度仍有70.36μm，明显高于对照组(P＜0.01)，表明电刺激能够显著提高神经元的抗衰老能力。钙离子荧光探针检测结果显示电刺激后三叉神经元细胞内的钙离子含量显著增加。同时Westernblot结果发现电刺激后三叉神经元细胞中钙离子相关信号通路蛋白PPP3CC和IP3受体蛋白的表达水平明显上调。此外，MAPK相关信号通路蛋白Erk1/2蛋白表达水平，以及RHEB和β-tubulinIII的蛋白表达水平，在细胞电刺激处理之后，均呈现明显上调。这些结果表明了电刺激可能通过影响钙离子相关信号通路和MARK相关信号通路来调节三叉神经元的生长情况。角膜共聚焦结果显示，LASIK术后3个月，兔眼在经过电刺激处理后，其中央角膜上皮下神经密度为5453.82μm/mm2，比对照组大幅增加了83%(2978.00μm/mm2，P＜0.05)。而LASIK术后3个月电刺激组兔眼的中央角膜浅基质层神经密度为7232.20μm/mm2，比对照组明显增加了52%(4749.00μm/mm2，P＜0.01)，说明电刺激能够促进LASIK术后角膜神经纤维的修复再生。裂隙灯结果显示，电刺激兔眼无角膜上皮缺损、角膜水肿和角膜混浊等情况；眼底照相和OCT结果显示，电刺激兔眼眼底黄斑和视盘区清晰，无肉眼可见的缺血或出血等情况，视网膜各层结构清晰，未见层间水肿、断裂等异常。说明本研究采用的眼用电极和电刺激参数对眼部无明显副作用。此外，在本论文所开发的纳米电极和电刺激技术的延伸应用中，PC12细胞的电刺激实验结果显示，电刺激能够大幅提高其轴突的生长能力，其轴突长度由对照组的26.63μm显著增长到了电刺激组的45.08μm(P＜0.001)，轴突长度相对增长了69%。PC12细胞划痕实验结果发现，电刺激实验组划痕的间隙为1020μm，相较于对照组的划痕间隙1304μm，缩小了22%，说明电刺激促进了神经元的定向迁移。
结论：本论文通过聚合增强边缘功能化球磨法制备了具有良好生物相容性和电化学活性的PANI-G纳米片，并在此基础上构建了高性能的神经电刺激纳米电极。PANI-G纳米膜电极用于电刺激可以显著提高体外三叉神经元细胞的轴突生长能力和抗衰老能力。此外，我们研究发现，电刺激能够引起三叉神经元细胞内钙离子含量的增加，其促进轴突生长的作用机制与钙离子相关信号通路和MAPK/Erk信号通路等的激活有关。动物实验结果显示，通过眼用PANI-G纳米电极进行电刺激，可以促进LASIK术后兔眼角膜神经的快速修复，而且本研究采用的眼用电极和电刺激参数对眼部无明显副作用。除了用于角膜神经损伤的修复，通过PC12细胞作为神经模型细胞相关实验表明，本论文开发的纳米电极和电刺激系统，能够显著提高神经细胞轴突的生长能力、促进神经细胞的定向迁移，因此有望应用到更多神经损伤性疾病的治疗中。综上所述，本论文基于纳米技术和纳米材料的独特性能，通过对电极材料的改性和电刺激技术的优化，构建了一个高效、安全的电刺激系统，能够用于高效的促进神经细胞轴突的生长，为LASIK术后因神经离断引起的干眼问题提供了一个有效的解决方案，同时也为多种神经损伤类疾病的治疗提供新的思路和借鉴。
方法：首先，我们采用本课题组自主发明的简便、环保的聚合增强球磨法对石墨粉和苯胺单体进行球磨加工，一步法得到聚苯胺化石墨烯复合材料(Polyaniline functionalized graphene,PANI-G)。采用原子力显微镜、拉曼光谱和红外光谱对所制备的PANI-G的理化性能进行表征，并通过CCK-8法和循环伏安法对PANI-G的生物性能和电化学性能进行检测。然后，从兔角膜神经来源的三叉神经节分离培养三叉神经元细胞，通过细胞形态和免疫荧光染色法对得到的细胞进行鉴定后，将其接种到PANI-G材料制备的膜电极上。在细胞粘附的PANI-G电极上施加电场进行电刺激，以细胞形态、轴突长度和细胞数量作为评价神经修复情况的指标。其后，用荧光钙离子探针对三叉神经元细胞内钙离子含量进行检测，由Westernblot检测钙离子相关信号通路及MAPK信号通路相关蛋白的表达量。通过比较电刺激组和对照组之间的差异，探讨电刺激促进神经修复的作用机制。我们进一步进行了动物实验以确定电刺激的修复作用。选用新西兰大白兔制作LASIK兔眼模型，模拟角膜神经丛的损伤。采用PANI-G材料制作的眼用纳米电极对术后兔眼进行电刺激，裂隙灯观察一般临床情况，用角膜共聚焦显微镜拍摄兔眼中央角膜上皮下及浅基质神经图像，并使用NeuronJ软件对所得图像进行处理，计算神经密度，作为电刺激角膜神经修复动物实验的评价指标。同时，实验兔电刺激后用裂隙灯显微镜、眼底照相机及光学相干断层扫描技术(Optical coherencetomography, OCT)对眼表和眼底情况进行观察，以评估眼用电极和电刺激参数对眼部的副作用。此外，为进一步扩展PANI-G纳米电极及电刺激技术的应用，我们选用PC12细胞作为神经模型细胞，将其接种到PANI-G膜电极上，施加电场进行电刺激，考察轴突长度和细胞数量的变化以评价神经的修复情况，并通过细胞划痕实验探讨电刺激对神经细胞定向迁移能力的影响。
结果：我们通过球磨苯胺单体和石墨粉混合物成功制备了PANI-G纳米材料，原子力显微镜结果显示其具有纳米片层状结构，厚度约为1.7nm。拉曼光谱结果显示其同时具有聚苯胺和石墨烯的特征峰，红外光谱结果显示其具有聚苯胺的特征峰，证明聚苯胺化石墨烯的成功合成。CCK-8的结果表明所合成的PANI-G在40μg/mL以下的浓度和细胞共培养72小时，细胞存活率超过80%。证实所制备的PANI-G纳米材料无细胞毒性，生物相容性良好。电化学循环伏安(CV)曲线结果发现，PANI-G的电化学活性比单纯机械球磨处理后的石墨粉提高很多。细胞形态学和神经元细胞的特异性蛋白(如β-tubulinⅢ、GAP43和NF200)的免疫荧光鉴定结果证实，我们成功从幼兔三叉神经节中分离提取到三叉神经元细胞。经过多次实验与条件摸索，我们确定在PANI-G膜电极上应用电刺激的条件为：以±500mV/cm的电场强度的低频双相脉冲电压，每天1小时的持续刺激时间，重复刺激5天后效果最佳。在最优电刺激条件下，三叉神经元细胞的轴突长度由对照组的53.25μm增长为电刺激后的84.24μm(P＜0.001)，神经元细胞的轴突长度显著增长了58%。此外，培养7天后的对照组的三叉神经元细胞呈衰老状态，细胞突起之间的网络连接变稀疏，而轴突长度减短为50.89μm。但是对于相同条件下进行连续7天电刺激的实验组，其细胞形态仍然保持神经元细胞典型的长轴突状态，轴突长度仍有70.36μm，明显高于对照组(P＜0.01)，表明电刺激能够显著提高神经元的抗衰老能力。钙离子荧光探针检测结果显示电刺激后三叉神经元细胞内的钙离子含量显著增加。同时Westernblot结果发现电刺激后三叉神经元细胞中钙离子相关信号通路蛋白PPP3CC和IP3受体蛋白的表达水平明显上调。此外，MAPK相关信号通路蛋白Erk1/2蛋白表达水平，以及RHEB和β-tubulinIII的蛋白表达水平，在细胞电刺激处理之后，均呈现明显上调。这些结果表明了电刺激可能通过影响钙离子相关信号通路和MARK相关信号通路来调节三叉神经元的生长情况。角膜共聚焦结果显示，LASIK术后3个月，兔眼在经过电刺激处理后，其中央角膜上皮下神经密度为5453.82μm/mm2，比对照组大幅增加了83%(2978.00μm/mm2，P＜0.05)。而LASIK术后3个月电刺激组兔眼的中央角膜浅基质层神经密度为7232.20μm/mm2，比对照组明显增加了52%(4749.00μm/mm2，P＜0.01)，说明电刺激能够促进LASIK术后角膜神经纤维的修复再生。裂隙灯结果显示，电刺激兔眼无角膜上皮缺损、角膜水肿和角膜混浊等情况；眼底照相和OCT结果显示，电刺激兔眼眼底黄斑和视盘区清晰，无肉眼可见的缺血或出血等情况，视网膜各层结构清晰，未见层间水肿、断裂等异常。说明本研究采用的眼用电极和电刺激参数对眼部无明显副作用。此外，在本论文所开发的纳米电极和电刺激技术的延伸应用中，PC12细胞的电刺激实验结果显示，电刺激能够大幅提高其轴突的生长能力，其轴突长度由对照组的26.63μm显著增长到了电刺激组的45.08μm(P＜0.001)，轴突长度相对增长了69%。PC12细胞划痕实验结果发现，电刺激实验组划痕的间隙为1020μm，相较于对照组的划痕间隙1304μm，缩小了22%，说明电刺激促进了神经元的定向迁移。
结论：本论文通过聚合增强边缘功能化球磨法制备了具有良好生物相容性和电化学活性的PANI-G纳米片，并在此基础上构建了高性能的神经电刺激纳米电极。PANI-G纳米膜电极用于电刺激可以显著提高体外三叉神经元细胞的轴突生长能力和抗衰老能力。此外，我们研究发现，电刺激能够引起三叉神经元细胞内钙离子含量的增加，其促进轴突生长的作用机制与钙离子相关信号通路和MAPK/Erk信号通路等的激活有关。动物实验结果显示，通过眼用PANI-G纳米电极进行电刺激，可以促进LASIK术后兔眼角膜神经的快速修复，而且本研究采用的眼用电极和电刺激参数对眼部无明显副作用。除了用于角膜神经损伤的修复，通过PC12细胞作为神经模型细胞相关实验表明，本论文开发的纳米电极和电刺激系统，能够显著提高神经细胞轴突的生长能力、促进神经细胞的定向迁移，因此有望应用到更多神经损伤性疾病的治疗中。综上所述，本论文基于纳米技术和纳米材料的独特性能，通过对电极材料的改性和电刺激技术的优化，构建了一个高效、安全的电刺激系统，能够用于高效的促进神经细胞轴突的生长，为LASIK术后因神经离断引起的干眼问题提供了一个有效的解决方案，同时也为多种神经损伤类疾病的治疗提供新的思路和借鉴。