猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)是引起猪气喘病(Mycoplasma pneumoniae of swine, MPS)的主要病原,也是猪呼吸道综合征(Porcine Respiratory Disease Complex, PRDC)的主要原发性病原之一。MPS是一种慢性的、传播性强的且在世界各地广泛分布的疾病,主要导致患猪生长缓慢、饲料转化率低并常常引起其他病原的继发感染,给养猪业造成巨大的损失。针对MPS的诊断方法,包括临床诊断、病理组织学诊断和实验室诊断方面的诊断方法,目前Mhp的诊断主要方法有分离培养法、免疫荧光法、核酸探针法以及聚合酶链式反应(Polym erase Chain Reaction, PCR)等,在当今规模化猪场中,猪感染后多呈慢性或隐性感染,这些方法虽然可以对病原做出诊断,但存在费时费力、代价高、敏感性和特异性不够理想等缺点。近年来,国内外开始利用荧光定量PCR技术检测猪肺炎支原体并对猪肺炎支原体进行精确定量的研究,但对以TaqMan荧光定量PCR定性定量检测Mhp的研究还比较少。目前研究较多的的猪肺炎支原体蛋白基因有P36、P46、P65、P97等,基于纤毛粘附因子P97是Mhp引起猪地方性肺炎的主要蛋白因子,本研究根据GenBank公布的Mhp P97基因序列,设计合成了特异性引物,PCR扩增Mhp168株的P97基因序列,克隆入pMD18-T载体,构建重组质粒pMD18-T/P97,经测序鉴定为标准阳性质粒。根据阳性质粒的拷贝数,建立标准曲线,标准样品浓度的对数与Ct值之间的线性关系方程为Y(Ct)=-3.41X+42.549；在国内首先建立了以P97为靶基因序列的TaqMan荧光定量PCR检测方法。通过测定Mhp菌液拷贝数后,将Mhp DNA进行10倍比稀释,以此来检测TaqMan荧光定量PCR检测方法的敏感性,敏感性达8.3copy/μL;通过与其他菌株进行TaqMan荧光定量PCR扩增比较,Mhp与其它病原无交叉感染,特异性良好；稀释后以不同浓度的质粒进行荧光定量PCR扩增,重复性良好,此方法可用于猪肺炎支原体培养物和组织样品的快速定量检测。在此基础上,将TaqMan荧光定量PCR检测方法应用于临床实践中,通过定量检测灭活前后猪肺炎支原体疫苗中Mhp基因含量,发现Mhp含量无显著变化,说明灭活不影响疫苗中Mhp基因含量；通过检测猪肺炎支原体在攻毒猪体内各组织的分布,发现猪肺炎支原体在呼吸器官含量最多,约为106copy/μL,而在其他组织分布较少,如在小肠、肌肉、脑、肝、心等组织中含量约为102copy/μL甚至更少,在肾、淋巴结中则无；采取43份猪肺组织,比较荧光定量PCR检测法与套式PCR检测法检测效果,荧光定量PCR检出率100%,套式PCR检出率为79%,验证了本试验中所建立的荧光定量PCR检测方法敏感性高于套式PCR；通过检测猪场病变猪肺组织中Mhp含量变化,可了解整个猪场感染Mhp的情况。这些均验证了所建立的TaqMan荧光定量PCR检测猪肺炎支原体方法能较好地运用于临床试验中。