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干旱、盐碱、低温等非生物逆境胁迫对植物的生长发育有重要影响,是农作物减产的直接原因。提高植物的抗逆性可以减轻胁迫伤害、提高产量、节约淡水资源,对农业增产、生态环境改良、实现可持续发展具有重要意义。DREB转录因子能特异性地与DRE元件(脱水应答元件)结合,激活许多逆境诱导基因的表达,它在植物对干旱、高盐及低温胁迫的分子反应中起着重要的调控作用。逆境胁迫下DREB转录因子能够调节功能基因的表达,普遍提高植物对逆境的抵抗和忍耐能力,因而能够综合改良植物的抗逆性状,是迄今为止最理想的植物抗逆工程基因。本研究以逆境处理的大白菜为试验材料,运用RT-PCR技术,克隆大白菜DREB转录因子基因cDNA序列,对逆境胁迫下的基因诱导表达模式进行了研究,并成功构建了植物表达载体,结果如下:1.根据已发表的甘蓝型油菜DREB转录因子基因序列设计引物DR2-1和DR2-2,进行RT-PCR扩增,得到两个长645bp编码214个氨基酸的基因,分别命名为BcDREB1(GenBank登录号为:EU924266)和BcDREB2(GenBank登录号为:GQ122331)。同源性分析表明,两个基因与甘蓝型油菜DREB2-2基因、芥菜DREB1B基因的氨基酸序列同源性均在90%以上。2.利用SMART和Protparam分析表明,BcDREB1推断的氨基酸相对分子量为23.90KD、等电点为4.88;BcDREB2推断的氨基酸相对分子量为23.85KD,等电点5.21,它们都包含一个典型的AP2结构域。3.半定量RT-PCR分析表明,低温、干旱、高盐均能诱导大白菜DREB基因表达。在低温胁迫时1h开始表达,3h到达最高;在高盐胁迫时1h开始表达,12h到达最高;在干旱胁迫时3h开始表达,12h到达最高。4.设计含有XbaI和BamHI酶切位点的正义特异性引物DR-F和DR-R,用BamHI和XbaI分别酶切含有BcDREB1基因的质粒和pCAMBIA2301载体,用T4 DNA Ligase连接,构建成大白菜BcDREB1基因的正义植物表达载体pCAM-BcDREB1。5.设计含有BamHI和XbaI酶切位点的反义特异性引物DR1-F和DR1-R,用BamHI和XbaI分别酶切含有BcDREB1、BcDREB2基因的质粒和pCAMBIA2301载体,分别用T4 DNA Ligase连接,构建成大白菜BcDREB1、BcDREB2基因的反义植物表达载体anti-pCAM-BcDREB1和anti-pCAM- BcDREB2。6.利用冻融法将植物表达载体pCAM-BcDREB1、anti-pCAM-BcDREB1和anti-pCAM-BcDREB2转化到农杆菌EHA105中,经特异性引物对转化菌液进行PCR扩增,证实表达载体已转入农杆菌。