真菌毒素是真菌生长过程中产生的次级代谢产物,它是粮食、饲料及食品中最常见的污染物之一。据联合国粮农组织估算,全球每年约20%的粮食作物因真菌毒素污染被弃用,由此造成的经济损失高达数千亿美元。真菌毒素污染仅对养猪业的损失就已超过50亿元。目前已知的真菌毒素种类超过300多种,最常见常见的危害较大的有黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮(F-2)毒素、伏马镰孢毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivenol, DON)、T-2毒素等。近年调查表明DON已成为饲料及原料中污染率最高,危害最广的真菌毒素。DON在小麦、燕麦和玉米等谷物中污染严重,由于其耐高温、高压和辐射等特性,经常通过食物链对人畜造成威胁。DON最早是因导致猪呕吐、拒食引起人们重视的。随后人们发现DON还可导致免疫力下降、生殖毒性、骨代谢紊乱及神经毒性等多系统毒性,多个系统中尤其以消化系统最为敏感。DON引起的采食下降及体重减轻等每年给畜牧业生产造成巨大损失。多项研究表明DON可导致肠组织肠病理学损伤,通透性改变从而导致肠营养吸收能力下降。然而胃是第一个消化器官,其功能正常与否直接影响肠道吸收能力。另外,胃粘膜分泌细胞分泌的胃泌素、生长抑素和ghrelin等对消化系统结构与功能调控具有关键作用。因此,研究DON对大鼠胃结构和功能毒性损伤及机理对阐明DON对消化系统的毒性机制具有重要意义。然而,有关DON对胃毒性损伤的研究还很少。本试验拟通过体内试验测定DON对大鼠分泌功能的影响；并从激素调控角度阐明导致分泌功能紊乱的原因。通过组织学和超微结构观察揭示DON对胃的组织及超微结构的毒性影响。利用体外试验检测细胞凋亡和氧化损伤,阐明DON引起粘膜损伤的分子机制。从而为DON中毒的防治提供理论依据。试验一DON对大鼠胃液分泌及胃液成分的影响本试验设计了成年wistar大鼠幽门结扎胃液收集模型。对其禁食24 h后按体质量0、1、5和25 mg·kg-1的DON剂量进行灌胃染毒,活动0.5 h后利用幽门结扎法收集4h内的总胃液。并对胃分泌功能,胃液消化能力和离子水平进行了测定。首先,对反映胃液分泌与消化相关指标进行了测定,包括胃液体积、pH值、粘蛋白含量、蛋白酶含量。与对照组相比,1、5和25 mg·kg-1 bw DON染毒大鼠胃液总体积分别下降了25%、51%和61%。胃液酸度也呈现剂量依赖性下降,pH值分别达到了3.2、3.81和6.65,而对照组只有1.9。阿利新蓝法对黏蛋白测定结果表明,胃液黏蛋白也有剂量相关的下降。类似的,胃蛋白酶含量分别下降了8%,18%和51%。以上结果表明,DON染毒抑制了大鼠胃的分泌功能。另外,本试验利用福林酚法对大鼠胃液蛋白酶活性进行了测定,结果表明1、5和25 mg·kg-1 bw DON染毒后胃液胃蛋白酶活性分别下降了27.97%、55.36%和67.82%。对胃液中残渣的称重结果表明DON染毒后残渣湿重分别增加了2倍、2.58倍和5.4倍；干重分别增加了43%、2.5倍和24.6倍。以上结果表明DON染毒抑制了大鼠胃液的消化功能。将胃液进行微波消解结合ICP法对胃液中的主要阳离子进行了测定。结果表明,DON染毒组胃液中Zn2+浓度上升,1 mg·kg-1 bw DON组Zn2+浓度差异不显著(p>0.05),在5和25 mg·kg-1 bw DON组Zn2+浓度分别升高了19%和122%。胃液内Na+,K+除1 mg·kg-1 bw DON染毒组轻微下降外,5和25 mg·kg-1 bw DON染毒组均出现了剂量相关性的增高。结果表明1、5 mg·kg-1 bw DON染毒导致Ca2+浓度明显的下降(p<0.05),5 mg·kg-1 bw DON染毒组大鼠胃液内Ca2+浓度明显升高(P<0.05)。结果表明,DON引起了离子代谢的紊乱。综上所述,本试验表明DON染毒抑制了大鼠胃的分泌功能和胃液消化能力,另外DON也干扰了大鼠胃内金属离子的代谢。试验二DON对大鼠胃内激素分泌与表达的影响试验一结果表明DON抑制了大鼠的胃液分泌功能,本试验研究了DON对胃内主要调控激素分泌与表达的影响,以揭示DON染毒情况下的激素调控机制。利用幽门结扎模型收集了胃液,利用放射性免疫分析法(Radioimmunoassay, RIA)对胃液中的胃泌素(gastrin、胃生长素(ghrelin)和生长抑素(Somatostatin, SS)的含量进行了进行了测定。结果表明1、5和25% mg·kg-1 bw DON染毒后,Gastrin总量分别下降了34%、59%和70%。gastrin的平均浓度分别降低了13%、16%和24%(p<0.05)。同gastrin检测结果相似,DON染毒组胃液总ghrelin分泌量呈现剂量相关的下降。1、5和25% mg·kg-1 bw DON染毒组胃液Ghrelin总量分别下降了29%、57%和67%；平均浓度分别下降4.5%、10.2%和15.3%(p<0.05)。对SS的测定结果表明,SS的平均浓度没有明显变化(p>0.05),总SS的分泌总量分别下降了25%、51%和62%。结果表明,DON抑制了胃液Gastrin和ghrelin的分泌总量,这与胃液体积下降有关。单位浓度除SS组没有明显的变化外,其他均出现下降。本试验还测定了大鼠染毒后0、1、2、4、8、12和24 h的激素分泌动态曲线。结果表明血浆中生长抑素没有明显变化。而血浆中gastrin和ghrelin有明显变化。在4 h以内,5和25% mg·kg-1 bw DON染毒组血浆中gastrin的水平降低于对照组和1mg·kg-1 bw DON组,之后出现反馈性增高。血浆中ghrelin的分泌基本和gastrin相似。试验表明,血浆ghrelin和gastrin出现明显的降低。本试验还测定了DON对胃组织内gastrin、ghrelin和SS基因表达的影响,对大鼠分别进行安慰剂和5 mg·kg-1 bw DON染毒,并于2 h后摘除胃并用Realtime PCR法测定。结果表明DON抑制了几种激素的基因表达。与对照组相比,5 mg·kg-1 bw DON染毒后幽门、胃体和胃底中gastrin的基因表达水平分别下降了88%、84%和54%。Ghrelin的结果类似,分别下降了90%、52%和50%。对SS mRNA测定结果表明,幽门的表达无明显变化(p>0.05),而在胃底和胃体分别下降了8%和10%。结果表明DON抑制了胃组织的基因表达,尤其是gastrin和ghrelin.综上所述,对胃液分泌功能具有促进作用的gastrin、ghrelin均出现蛋白和mRNA水平的降低,而生长抑素分泌与表达没有明显的变化。说明gastrin和ghrelin两种激素的分泌和mRNA水平降低,可能是导致胃液分泌能力下降的重要原因。试验三DON对大鼠胃及胃粘膜细胞损伤研究胃粘膜及细胞结构是胃分泌及其他功能的生理基础,本试验主要结合体内和体外试验探讨DON对胃粘膜及上皮细胞的损伤情况。在体内,对比了DON染毒对大鼠胃粘膜病理学结构的影响,并利用透射电镜观察了胃粘膜细胞超微结构变化。结果表明,1和5 mg·kg-1 bw DON染毒对大鼠胃粘膜没有明显病理损伤,在25 mg·kg-1 bw DON组出现了胃粘膜损伤,出现脱落的胃粘膜粘膜上皮细胞。超微结构观察表明,DON染毒主要导致线粒体损伤、细胞膜膜结构不完整及核破裂。线粒体出现嵴消失和空泡化现象；细胞膜变薄,并出现结构不完整,磷脂双分子层结构破坏。细胞核出现破碎及核仁皱缩现象。为了验证DON对大鼠胃粘膜损伤情况,体外培养了大鼠胃粘膜细胞(RGMCs)。对细胞以0,125,250,500,1000,2000 ng·ml-1的剂量进行染毒。结果表明染毒24 h后125、250 ng·ml-DON染毒后细胞间隙开始变宽。在500、1000和2000 ng·ml-1 DON染毒后开始出现凋亡细胞。同时利用Annexin V-FITC/PI双染法在流式细胞仪检测细胞凋亡与坏死情况。结果表明,凋亡率从对照组的6.98%上升到了125、250、500 ng·ml-1组的12.33%、14.37%和17.24%,组间差异显著(p<0.05)。在1000 ng·ml-1 DON组细胞凋亡最明显,占总细胞的24.41%。对细胞坏死率的统计表明,在0、125、250和500 ng·ml-1剂量组均无明显细胞坏死,而在1000和2000 ng·ml-1剂量组突然出现明显坏死,坏死率分别达到了22%和29%。最后,测定了细胞膜电阻情况,试验表明DON降低了细胞膜电阻,说明DON降低了细胞膜的完整性。综上所述,DON灌胃染毒在25 mg/kg bw组引起胃粘膜受损,其他未见明显变化。线粒体损伤、细胞膜通透性改变是亚细胞水平的变化。体外实验表明,这些损伤与DON导致的细胞凋亡、坏死及细胞膜完整性下降有关。试验四DON对RGMC氧化损伤的影响试验三表明DON引起了RGMC的细胞线粒体损伤和细胞膜结构破坏,本试验研究了DON对细胞氧化应激、抗氧化能力的影响,对揭示氧化损伤机制在DON毒性中的作用提供依据。本实验体外培养了RGMC细胞,利用125、250、500、1000和2000 ng·ml-1DON的浓度对细胞染毒,对24h后的上清、细胞进行氧化损伤测定。对脂质过氧化物(LPO)和丙二醛(MDA)的检测结果表明DON引起了LPO和MDA的增多,250、500、1000和2000 ng·ml-1DON染毒使细胞内LPO分别增加了10%、27%、67%和107%,只有在125 ng·ml-1DON染毒组LPO含量基本不变(P>0.05)。同样,DON导致了MDA剂量依赖性增加,在125、250、500 ng·ml-1DON组分别增加了24%、78%和126%。1000和2000 ng·ml-1DON染毒组MDA的含量达到了对照组的3.04倍和3.48倍。以上结果表明DON导致了细胞的氧化应激。本试验还测定了DON对RGMC细胞的总抗氧化能力(T-AOC)和氧化酶活性的影响。结果表明,DON降低了RGMC的总抗氧化能力,与对照组相比,125、250、500、1000 ng·ml-1DON组细胞的T-AOC分别下降了12%、19%、25%、30%,2000 ng·ml-1DON染毒组细胞的T-AOC下降达到了35%。对细胞抗氧化酶的活性测定结果表明,按125 ng·ml-1DON剂量对大鼠染毒后SOD活性基本不变(p>0.05)。250、500 ng·ml-1 DON染毒组分别降低了5%、15%和38%,而2000 ng·ml-1 DON染毒组SOD活性降低达到了51%。类似地,DON降低了细胞内过氧化氢酶(CAT)的活性。与对照组相比,活性分别下降了8%、29%、39%和46%。GSH-Px的活性在125、250和500 ng·ml-1DON染毒组分别降低了8%、16%和22%。1000和2000ng·ml-1DON染毒组分别下降了38%和51%。表明DON降低了RGMC的抗氧化能力,而抗氧化酶活性降低是其主要原因。综上所述,DON引起了IRGMC的氧化应激,这与细胞内抗氧化酶活性下降有关。DON引起的氧化应激是导致的线粒体损伤的重要原因,详细机制下一步进行研究。