简单节杆菌（Arthrobacter simplex）是目前国内工业上常用的甾体C1,2脱氢反应菌株,3-甾酮-Δ1-脱氢酶（3-ketosteroid-Δ1-dehydrogenase,KsdD）是催化该反应的关键酶。课题组前期对工业菌株Arthrobacter simplex TCCC 11037进行了全基因组测序,生物信息学结果暗示,该菌株中5个基因的功能注释为KsdD（依次命名为KsdD1、KsdD2、KsdD3、KsdD4与KsdD5）。在此基础上,本文克隆得到系列ksdD基因,通过异源表达和过表达菌株的构建及其催化活性分析,对其底物偏好性和体内功能展开初步分析。生物信息学分析结果表明,简单节杆菌这5个KsdD之间的氨基酸序列一致性在35%～54%之间波动,与已知结构的红平红球菌SQ1中KsdD1之间的氨基酸序列一致性在36%～52%之间波动。此外,这5个KsdD在理化性质、细胞定位、蛋白跨膜区、信号肽、蛋白二级结构等方面表现出多样性,且和已知结构的红平红球菌SQ1中的KsdD1具有明显差异。利用异源表达技术将5个ksdD在E.coli BL21（DE3）进行表达,酶活与全菌转化结果表明,KsdD1、KsdD3、KsdD4与KsdD5在体外表现出了 KsdD的催化活性,而KsdD2无活性。利用破碎后的上清液作为粗酶液进行底物偏好性分析,结果表明,简单节杆菌的KsdD1、KsdD3、KsdD4和KsdD5之间底物偏好性存在一定差异。KsdD4对3-酮基甾体化合物表现出较高的催化活性,并且对一些特定的底物（如19-羟甲基二酮）也具有转化能力,其底物谱的范围明显优于阳性对照（红平红球菌SQ1的KsdD1、紫红红球菌DSM 43269的KsdD2和新金分枝杆菌TCCC 11208中的KsdD）。利用穿梭表达载体pART2AN构建系列简单节杆菌ksdD过表达菌株。全菌转化的结果表明,所有过表达菌株转化AD生成ADD的初始反应速率和产量均高于对照菌株。其中,KsdD3过表达菌株在转化0-6 h的初始转化速率为0.072 g/L·h,比对照菌株（0.052 g/L·h）提高了 38.5%,转化36 h后的ADD产量最大,为0.67 g/L,比对照菌株（0.48 g/L）提高了 39.5%,然后依次排序是 KsdD2＞KsdD5＞KsdD4＞KsdD1。体外和体内功能验证发现KsdD3的效果最为明显,这暗示着KsdD3在菌株的C1,2脱氢反应中发挥着更为重要的作用。论文成果是对目前简单节杆菌关键催化酶KsdD研究认识的新补充,具有重要的科学意义。利用pK18mobsacB自杀载体,以ksdD4为目标基因进行简单节杆菌敲除技术的初步探索。结果发现,简单节杆菌的同源重组的效率非常低,利用该敲除系统无法在简单节杆菌中实现基因的敲除。该工作为今后建立简单节杆菌基因敲除系统提供了重要的基础数据。