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猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)以及猪轮状病毒 A 型(Group A rotavirus,GAR)是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原。这三种仔猪腹泻病的临床鉴别较困难,因此新的鉴别诊断方法一直是生产中亟待解决的难题。本研究以PEDV、TGEV以及GAR为研究对象,结合金标银染技术和不对称PCR单链扩增技术构建了一套PEDV-TGEV-GAR联合共检可视化基因芯片,并优化其制备及检测方法,进行初步临床应用评价研究。主要研究内容如下:1.共检可视化基因芯片的构建与优化(1)目的基因引物及探针的设计本研究在前期的基础上,根据Genbank中收录的基因序列,针对PEDV的M及S保守基因;TGEV的S及N保守基因;GAR的VP7及NSP4保守基因分别设计特异性引物。根据各目的基因片段正义链序列分别设计两条长度约为45 bp的探针。(2)共检可视化基因芯片的构建与检测技术优化本研究针对可视化基因芯片的制备方法及其检测程序进行了探索和优化,确定了可视化基因芯片的标准化制备方法、目的基因单链的扩增标记方法、可视化基因芯片的标准化检测方法以及结果判定标准。根据每段目的片段正义链序列分别设计两条长度约为45bp的寡核苷酸探针,在其5端添加15个T碱基,并进行氨基化修饰。进行点样缓冲液稀释后进行喷样。以提取重组质粒的DNA为模板,利用预先设计好的特异性引物对,经不对称PCR扩增对靶基因进行生物素标记。在不对称PCR的扩增标记体系中,对每个靶基因下游引物进行5’端生物素标记,控制上游引物与下游引物的浓度比例,制备大量带有生物素标记的单链靶基因。经过杂交程序和金标银染程序后,观察检测结果。2.共检可视化基因芯片的构建及检测技术优化结果结果显示,利用Baio(?)点样缓冲液对探针溶液进行1:1比例稀释后,按照预先设计的芯片探针矩阵对醛基基片进行一次性喷样。喷样完成后37℃水化过夜(10h),使用含0.5%BH4Na,25%Ethanol,0.75 ×PBS的封闭液进行封闭,经过洗涤程序后,600 r/min离心干燥,4 ℃保存。PEDV-M基因的上游引物与下游引物的浓度为1:10时,其目的片段单链产量最大;PEDV-S、TGEV-S、TGEV-N、GAR-VP7及GAR-NSP4基因目的片段单链的最佳上游引物与下游引物的浓度为1:20。确定了芯片检测的操作程序为:在45 ℃环境中杂交90 min后,进入洗涤程序。与4 μg ·mL-1链霉亲和素修饰的纳米金颗粒结合,用ddH20温柔冲洗后再进行12min-14min银染。本研究根据阳性对照生成灰黑色斑点,空白对照无斑点生成,确定了芯片检测质量与结果判定标准。3.共检可视化基因芯片检测技术的评价本研究对可视化基因芯片的特异性、灵敏性和保存期进行了试验,并将其应用于临床样本检测,比较其与RT-PCR检测结果的吻合度。(1)特异性、灵敏性和保存期评价分别将PEDV、TGEV、GAR、CSFV、PRRSV、PCV2及JEV的标记产物与芯片进行杂交,以检测其特异性;将重组质粒DNA,经不对称PCR扩增标记后,分别作l0x系列倍比稀释后与芯片进行杂交,以检测其灵敏性;将同一批标准化制备完成的芯片,分别保存30天、60天、90天、120天及180天后,分别取出进行杂交检测,以检测其保存期。结果表明,可视化共检芯片特异性好,PEDV、TGEV、GAR的单独检测及混合检测杂交结果均呈阳性,CSFV、PRRSV、PCV2及JEV杂交结果呈阴性,探针之间没有相互干扰;可视化共检芯片灵敏度可达22.8 pg · μL-1;芯片在保存180天后仍可进行有效检测。(2)共检可视化基因芯片的临床应用评价本研究应用所构建的芯片对四川省21个地区的225份临床送检样本进行了检测。提取病死猪的小肠组织及小肠内容物基因组RNA,反转录成cDNA后用不对称PCR扩增标记后进行可视化芯片杂交检测,比较其与RT-PCR检测结果的吻合度。结果表明;PEDV、TGEV、GAR的阳性感染率为64.89%,其中PEDV的单纯感染率为60.45%,PEDV+TGEV的混合感染率为4.44%,以PEDV的单纯感染情况较为普遍,没有GAR感染。可视化基因芯片与RT-PCR的检测总符合率均为100%,表明所构建的可视化基因芯片可用于临床样本的检测。