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目的:探讨哈蟆油蛋白酶解物（Oviductus Ranae protein hydrolysate,ORPH）对骨质疏松模型大鼠保护作用,建立骨质疏松大鼠定量蛋白组学,并进行生物信息学分析,阐述ORPH抗骨质疏松的作用机制。方法:采用碱性蛋白酶酶解法制备ORPH,并利用紫外光谱、红外光谱、蛋白特征显色、SDS-PAGE电泳、氨基酸色谱等方法鉴定ORPH的相关理化性质。利用H2O2损伤MC3T3-E1细胞,MTT法筛选ORPH最佳给药浓度和时间。利用去势法复制骨质疏松大鼠模型,用X-光射线法测定大鼠骨密度（Bone mineral density,BMD）,用改良Trizol法制备总RNA,qPCR法检测骨代谢相关基因mRNA表达水平,Western-blotting法检测骨代谢相关蛋白表达水平,HE染色法观察股骨骨小梁结构变化,免疫组化法评价碱性磷酸酯酶（Alkaline phosphatase,ALP）、骨形态发生蛋白-2（Bone morphogenetic protein2,BMP2）的蛋白表达水平。TMT标记法标记胰蛋白酶水解后肽段,超高效液相法将标记肽段分级,LC-MS联用分析检测肽段母离子及其二级碎片,用生物信息学法进行蛋白注释、结构域注释、KEGG通路注释及亚细胞定位,并进行蛋白功能富集和聚类分析。结果:1.通过评价酶解时间和哈蟆油黏度值变化确定了ORPH制备的最佳水解酶为碱性蛋白酶。通过SDS-PAGE比较缓冲液提取法和碱性蛋白酶酶解法制备的ORPH分子量分布,哈蟆油酶解后的ORPH分子量明显减小,更容易被机体吸收利用。酶解后得到的ORPH分子量主要集中在30kD及以下,蛋白含量约为60%。极大改善了哈蟆油的水溶性,并消除了哈蟆油的腥臭异味。2.开展了ORPH相关理化性质鉴定。ORPH的最大紫外吸收波长为280-290nm。IR特征吸收官能团为“-COOH”和“-CONH”。ORPH含有17种氨基酸,其中含量最高的为苏氨酸（Thr）,含量为4.87%,氨基酸种类水解前后无变化。双缩脲反应和茚三酮反应,ORPH均显阳性结果。3.用H2O2致成骨细胞MC3T3-E1损伤,建立了氧化损伤模型。给予ORPH干预治疗,MTT法筛选最佳给药时间和给药浓度为400ug/mL和24h。在显微镜下观察可见,空白对照组细胞呈梭形,模型对照组细胞数量减少,与模型对照组比较,ORPH给药组细胞数量增多,细胞的皱缩现象有所改善,其中400ug/mL给药组胞体皱缩现象明显改善。4.评价了ORPH对H2O2损伤MC3T3-E1细胞骨代谢相关maker的调控。ORPH给药组ALP与BMP2 mRNA相对表达量均显著性上调（P<0.01）,Osteocalcin和Runx-2 mRNA相对表达量呈现上调趋势。ORPH给药组ALP、Runx-2和Osteocalcin的蛋白表达明显增加（P<0.01,P<0.05）,BMP2蛋白呈现上调表达趋势,ORPH能够促进成骨细胞增殖和分化,对H2O2损伤MC3T3-E1细胞有一定的保护作用。5.建立了骨质疏松大鼠模型。与空白组比较,模型组大鼠BMD显著降低（P<0.01）,模型建立成功;与模型组比较,给予ORPH治疗90d后,大鼠股骨和腰椎的BMD显著升高（P<0.01,P<0.05）。同时,ORPH能显著改善股骨的BMD和最大载荷量,增强股骨韧性,降低骨折风险。但ORPH对骨质疏松大鼠的体重变化作用不明显。6.开展了大鼠相关脏器组织和股骨病理学检测。对去势成年大鼠送检脏器进行组织病理学检查,仅个别系统组织器官出现了轻微炎症,ORPH组未见明显毒性改变。HE染色显示,ORPH能保护股骨骨小梁结构,促进骨小梁排列有序,结构完整,显著降低骨折风险。7.考察了ORPH对骨质疏松大鼠骨代谢相关maker的调节作用。qPCR实验和Western-blot实验证实,ORPH能够上调ALP,Osteocalcin,Runx-2,BMP2基因mRNA和蛋白的相对表达;同时ORPH对破骨细胞相关蛋白TRAP的表达有一定的抑制作用,ORPH对骨代谢平衡有重要调节作用。8.免疫组化实验表明ORPH能明显促进骨质疏松大鼠体内的ALP和BMP2的分泌与表达,从而影响骨骼分化及生长,参与骨代谢过程。9.共鉴定到5654个蛋白质,其中4889个蛋白质具有定量信息注释。以差异倍数值变化超过1.2倍作为显著上调、小于1/1.2作为显著下调的变化标准,与空白组比较,上调表达蛋白有195个,下调表达有204个;与模型组比较,给予ORPH干预后,上调表达蛋白有230个,下调表达蛋白有299个。10.使用KEGG通路数据库对蛋白通路进行注释,使用KEGG在线服务工具KAAS对提交的蛋白进行注释,通过KEGG mapper将注释过的蛋白匹配入数据库中相应的通路中。将模型组与空白组数据进行差异表达蛋白富集分析,富集到KEGG Pathway共11条（P<0.05）。其中富集程度最高的3条Pathway分别Ribosome信号通路,Focal adhession信号通路和ECM-recepertor interaction信号通路。将ORPH给药组与模型组数据进行差异表达蛋白富集分析,富集到KEGG Pathway共14条。其中富集程度最高的2条Pathway分别Ribosome信号通路和Complement and coagulation cascades信号通路。11.以差异倍数值变化超过2倍作为显著上调、小于1/2作为显著下调的变化标准,共筛选出差异蛋白33个。其中,Osteoporosis VS Control组,上调表达蛋白6个,下调表达蛋白16个;ORPHDrug VS Osteoporosis组,上调表达蛋白7个,下调表达蛋白4个。统计表明去势手术引起的差异表达蛋白与ORPH干预治疗引起的差异表达蛋白,存在7个共有差异蛋白,分别是半乳糖凝集素（Galectin,Gal）,丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serine protease inhibitor A3K,SerpinA3k）,免疫球蛋白样结构域（Immunoglobulin-like domain,Ighm）,肌球蛋白轻链3（Myosin light chain 3,Myl3）,肌钙蛋白I（Troponin I,Tnni1）,心肌肌钙蛋白C（Cardiac troponin C,TnnC1）、一种免疫球蛋白样结构域（Ig kappa chain C region,IgkC）。给予ORPH治疗后,Gal,Myl3,SerpinA3k等7个差异蛋白表达水平均恢复到正常水平（P<0.01）。结论:本研究成功建立了骨质疏松大鼠模型,证实ORPH能提高大鼠BMD、最大载荷量、促进成骨细胞分化、调节相关骨蛋白表达,参与骨代谢调节。ORPH保护骨质疏松大鼠的作用机制可能是通过调控Gal,Myl3,SerpinA3k等7个关键蛋白,激活相应信号通路,保护成骨细胞分化,促进成骨细胞生长,促进新陈代谢和骨骼再生长,阻止抗氧化剂应激损伤,维持大鼠体内骨代谢平衡,从而发挥抗骨质疏松作用。