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研究背景和目的肠道病毒71型(EV71)是手足口病的主要病原体,尤其是重症手足口病的主要病因(80%以上)。手足口病重症患者往往伴有EV71的神经系统感染,并且易留下神经系统后遗症,甚至出现死亡。目前,EV71甚至已经成为超越脊髓灰质炎病毒的最主要的中枢神经毒性的病毒,因此预防EV71的神经系统感染是降低手足口病死亡率的关键,也是手足口病防治的重点。相关研究发现EV71病毒的毒力改变与病毒基因组内部编码的氨基酸的突变有密切关系。也有文献证明VIM是细胞表面EV71受体。本课题组前期的流行病学研究发现:EV71病毒的结构蛋白VP1的A289T的变异与重症手足口病的发生密切关联,当289位点的氨基酸为A丙氨酸时,EV71感染神经系统明显升高(P<0.05,OR=2.36,95%CI为1.163-4.659)。同时证实Vimentin是HBMEC细胞表面EV71的受体,并影响EV71在细胞中的复制与释放。本研究拟进一步对以上结果进行生物学实验验证。通过反向遗传学技术定点突变病毒VP1蛋白289位点、拯救病毒,利用体外实验和动物模型研究突变前后病毒的毒力及特性,初步探索VP1蛋白的A289T变异对EV71病毒感染神经系统的影响。利用体外实验和动物模型进一步的研究Vimentin影响EV71病毒感染。研究方法1.EV71病毒定点突变与病毒拯救运用分子克隆技术、反向遗传学技术将EV71-289A感染性质粒扩增后,定点突变为EV71-289T感染性质粒。野生型和突变型质粒经体外转录得到RNA,病毒RNA转染宿主细胞,获得两种拯救病毒。2.病毒生物特性的检测将两种拯救病毒感染RD细胞,运用细胞技术、PCR、Westemblot等技术,进行病毒的感染性、活性、稳定性、病毒定量的检测;以及两种病毒在HBMEC细胞中感染情况的比较。3.病毒感染动物模型建立动物模型,经腹腔注射分别感染两种拯救病毒,观察小鼠的病变情况,统计两种病毒的发病情况,并且用实时荧光定量PCR检测在小鼠的脑组织中进行病毒定量,HE染色观察脑组织的病变;用免疫组织化学方法检测脑组织中的病毒颗粒;进行两种病毒的毒力或者特性比较。结果1.EV71-289T感染性克隆突变成功;EV71A、EV71T病毒的拯救完成。2.两种拯救病毒在RD细胞中的侵袭、复制扩增、释放能及病毒自身蛋白合成能力相同,两者差异无统计学意义(P>0.05)。3.两种拯救病毒可感染HBMEC细胞。相同MOI感染HBMEC细胞,EV71A病毒粘附量多于EV71T病毒(P<0.05),EV71病毒在HBMEC对照细胞(CON)的吸附量是 VIM-KO 细胞的 1.2 倍多[CON:EV71A(1.00±0.15),EV71T(0.58±0.14),VIM-KO:EV71A(0.75±0.06),EV71T(0.47±0.20)]。MOI=10,病毒感染对照细胞24h、48h,细胞内EV71A核酸含量分别是EV71T核酸量的1.3 倍、3 倍[24h:EV71A(13.7±0.63),EV71T(10.62±0.64),48h:EV71A(100.42±0.85),EV71T(30.48±0.42)];VIM-KO 细胞中分别是 1.7 倍、1.8倍[24h:EV71A(2.94±0.96),EV71T(1.72±0.88),48h:EV71A(6.58±0.48),EV71T(3.58±0.81)](P<0.05);细胞上清中EV71A核酸含量分别是EV71T的 2.2 倍、1.6 倍[24h:EV71A(1.00±0.05),EV71T(0.44±0.05),48h:EV71A(8.82±0.16),EV71T(5.35±0.07)];VIM-KO 细胞上清的分别是 1.4 倍、1.2倍[24h:EV71A(0.27±0.05),EV71T(0.18±0.08),48h:EV71A(0.68±0.06),EV71T(0.54±0.05)];VIM-KO中病毒核酸含量小于CON对照细胞(P<0.05)。4.病毒感染BABL/c小鼠发病情况:108pfu病毒量:EV71A组发病率95.12%(39/41),EV71T 组发病率 60.47%(26/43);107pfu 病毒量:EV71A 组发病率36.36%(8/22),EV71T 组发病率 11.76%(2/17)(P<0.05)。5.病毒感染SV129小鼠发病情况:VIM+/+SV129小鼠:108pfu病毒量:EV71A 组发病率 69.23%(27/39),EV71T 组发病率 42.5%(17/40)(P<0.05);107pfu 病毒量:EV71A 组发病率 52.78%(19/36),EV71T 组发病率 22.86%(8/35)(P<0.05);VIM-/-SV129小鼠:108pfu病毒量,两病毒组发病率均为10%(1/10);107pfu病毒量,两实验组均未发病。6.EV71A组小鼠脑组织病毒含量约为EV71T组的9.5倍[EV71A(2256.66±50.22),EV71T(237.75±36.15)](P<0.05)。结论1.EV71病毒VP1蛋白A289T氨基酸变异后,病毒EV71毒力降低。2.验证了 VIM蛋白是HBMEC细胞的EV71受体,VIM蛋白是SV129小鼠体内EV71的受体。VIM影响EV71的粘附、复制以及病毒释放能力。