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茯苓Wolfiporia cocos是多孔菌科Polyporaceae,茯苓属Wolfporia的地下菌核,在我国常作为药食两用的中药材。近年来,随着分子生物学技术的应用不断拓展,应用现在分子生物技术研究真菌类中药,已成为当前中药真菌的研究前沿。本课题采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,对在不同条件下的茯苓内参基因进行筛选研究,以获取合适的内参基因校正目的基因的表达量,为研究茯苓基因的表达调控,揭示茯苓菌核的生物学特性,科学的指导茯苓种植提供了理论依据。本研究选取了10个内参基因:28S核糖体RNA亚基(28S),18S核糖体RNA亚基(18S),甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH),核糖体蛋白L4(RPL4),真核延伸因子1α(EF1-α),真核延伸因子1β(EF1-β),DNA指导的RNA聚合酶亚基2(RPB2),肌动蛋白(ACT),微管蛋白α(α-TUB)和微管蛋白β(β-TUB)。利用qRT-PCR技术分别检测其在茯苓3个不同生长时期、2个不同组织以及在高盐,高糖和高pH值等逆境条件下菌丝中的表达量,使用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3种内参筛选软件综合分析,比较10个候选基因的表达稳定性。实验结果如下:1、根据10条已公布的内参基因序列设计引物,通过PCR扩增出10个内参基因片段,在NCBI上经BLAST比对后,发现10个内参基因序列与其他物种同源基因具有高度相似性。2、在传统Trizol法步骤中加入乙酸钠、β-巯基乙醇进行体系优化后,提取茯苓子实体3个不同发育阶段的不同组织以及茯苓菌丝在不同胁迫条件下的总RNA。结果显示,18S和28S两条条带分离清晰,带型整齐。3、geNorm软件分析显示:在茯苓不同生长阶段中,内参基因表达稳定性为:28S>α-TUB>18S>RPB2>GAPDH>EF1-α>β-TUB>RPL4>EF1-β>ACT;NormFinder软件分析结果为:GAPDH>28S>18S>RPB2>α-TUB>RPL4>EF1-α>β-TUB>EF1-β>ACT;BestKeeper软件分析结果则显示最稳定的内参基因为28S和GAPDH。综合三个软件分析得到的结果,推荐使用28S作为内参基因。4、geNorm软件分析显示:在茯苓不同组织中,内参基因表达稳定性为:α-TUB>GAPDH>28S>RPL4>EF1-α>β-TUB>18S>EF1-β>RPB2>ACT;NormFinder软件分析结果为:28S>α-TUB>18S>β-TUB>EF1-α>GAPDH>EF1-β>RPB2>RPL4>ACT;BestKeeper软件分析结果则显示最稳定的内参基因为α-TUB和28S。综合三个软件分析得到的结果,推荐使用α-TUB和28S作为内参基因。5、geNorm软件分析显示:在不同逆境环境中,内参基因表达稳定性顺序为:GAPDH>ACT>28S>EF1-α>α-TUB>18S>RPB2>β-TUB>EF1-β>RPL4;NormFinder软件分析结果为:ACT>28S>GAPDH>RPB2>EF1α>18S>α-TUB>EF1-β>β-TUB>RPL4;BestKeeper软件分析结果则显示最稳定的内参基因为GAPDH和ACT。综合三个软件分析得到的结果,推荐使用GAPDH和ACT作为内参基因。6、geNorm软件分析显示:在茯苓所有样品中,内参基因表达稳定性顺序为:GAPDH>α-TUB>28S>RPB2>18S>β-TUB>ACT>EF1-β>RPL4>EF1-α;NormFinder软件分析结果为:α-TUB>RPB2>28S>GAPDH>18S>EF1α>ACT>β-TUB>RPL4>EF1-β;BestKeeper软件分析结果则显示最稳定的内参基因为α-TUB和RPB2。综合三个软件分析得到的结果,推荐使用α-TUB作为内参基因。结论:本课题筛选出的GAPDH、α-TUB基因可以作为研究茯苓基因表达量的稳定内参基因,实验结果为茯苓菌核的种植提供了工作基础。