精子型乳酸脱氢酶LDH-C4在高原鼠兔体细胞中表达

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高原鼠兔(Ochotona curzoniae)是一种生活在青藏高原海拔3000~5000m地区,对低温,低氧有很好耐受性的小型啮齿类土著动物。前期研究表明雌雄高原鼠兔心脏,肝脏,肺,肾脏,大脑,骨骼肌的LDH同工酶谱均显示一致的六条带,并且和睾丸组织的LDH同工酶谱完全一致,我们推测LDH-C4在高原鼠兔体细胞中表达。  为了证实LDH-C4在高原鼠兔体细胞中表达,通过分子克隆方法在高原鼠兔体细胞克隆Ldh-a,Ldh-b,Ldh-c的序列;通过RealtimePCR检测不同海拔高原鼠兔Ldh-a,Ldh-b,Ldh-c的表达量;通过原核表达系统分离纯化高原鼠兔LDH-C4,结合乳酸脱氢酶同工酶的热稳定性,利用活性染色法确定LDH-C4在高原鼠兔体细胞乳酸脱氢酶同工酶谱中的位置。  结果表明:1.高原鼠兔Ldh-a基因全长1693bp,编码区长度为999bp,高原鼠兔Ldh-a的编码区与牛,人,大鼠,小鼠,兔子的同源性分别为87.89%,88.19%,85.69%,86.29%,88.99%和88.49%;高原鼠兔Ldh-b基因全长1299bp编码区长度为1005bp,鼠兔Ldh-b的编码区序列与牛,人,大鼠,小鼠,猩猩的同源性分别为88.46%,90.15%,86.67%,86.47%,90.15%;Ldh-c在高原鼠兔心脏,肝脏,肺,肾脏,大脑中表达,编码区与睾丸中Ldh-c的序列完全一致,高原鼠兔体细胞Ldh-c与Ldh-a,Ldh-b的同源性分别为74%和68%。2.随着海拔高度的增加在高原鼠兔心脏中,Ldh-a,Ldh-b的表达量极显著下降(P<0.01),Ldh-c的表达量下降差异不显著(P>0.05);随着海拔高度的增加高原鼠兔肝脏中,Ldh-a,Ldh-b的表达量下降差异不显著(P>0.05),Ldh-c的表达量极显著下降(P<0.01);随着海拔高度的增加高原鼠兔肺中Ldh-a表达量显著下降(P<0.05),Ldh-b,Ldh-c的表达量下降差异不显著(P>0.05);随着海拔高度的增加高原鼠兔肾脏中Ldh-a的表达量增加差异不显著(P>0.05),Ldh-b表达量下降差异不显著(P>0.05),Ldh-c表达量极显著减少(P<0.01);随着海拔高度的增加高原鼠兔大脑中Ldh-a(P<0.05)和Ldh-b(P<0.01)的表达量显著降低,Ldh-c表达量下降但差异不显著(P>0.05);随着海拔高度的增加高原鼠兔骨骼肌中Ldh-a的表达量降低差异不显著(P>0.05),Ldh-b表达量显著下降(P<0.05),Ldh-c表达量极显著减少(P<0.01);随着海拔高度的增加在高原鼠兔睾丸中,Ldh-a,Ldh-b,Ldh-c的表达量下降但差异不显著(P>0.05)3.成功构建高原鼠兔LDHC原核表达系统,分离纯化得到了具有酶活性的高原鼠兔LDH-C4。4.通过乳酸脱氢酶活性染色法,结合乳酸脱氢酶同工酶的热稳定性,证实高原鼠兔体细胞乳酸同工酶谱中从阴极到阳极的第三条带是LDH-C4。结果表明Ldh-c在高原鼠兔的体细胞中表达,体细胞中LDH-C4的表达可能是高原鼠兔对低氧的一种重要的适应机制。
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