由于现代交通与工业的迅猛发展,各种高能量创伤导致的骨盆骨折发生率逐年增加。骶骨骨折或骶髂关节脱位等骨盆后环的不稳定损伤极易伴发骶神经神经损伤,发生率高达56.8%[1]。骶丛神经损伤可能导致患者下肢运动及感觉功能障碍,同时可能出现膀胱及性功能不全。传统治疗手段为保守治疗或骨折切开复位内固定及神经减压,但效果不佳,尤其是当骶丛神经出现根性撕脱伤时其治疗更加困难棘手,长久以来一直是骨科亟待解决的临床难题。虽然近年有少数手术方法修复骶丛损伤尝试[2-4],但最终仅取得下肢功能少部分恢复。课题组前期在猕猴的动物实验中已经证实切断腰6(即人类骶1)神经根的安全性[5]及健侧腰6神经根移位修复骶丛撕脱伤的有效性[6],在此基础上,我们研究了骶1神经根在人类下肢主要骨骼肌的神经支配情况,发现骶1神经根主要支配臀中肌、臀大肌、股二头肌、腓骨长肌、腓肠肌内侧头、腓肠肌外侧头及趾短伸肌,其对下肢主要骨骼肌的神经支配均可通过腰4,腰5,骶2和骶3神经根代偿,其神经支配所占比重最大为腓肠肌外侧头51.38%。我们最终通过临床、电生理等多种检测手段证实了健侧骶1神经根移位修复单侧骶丛撕脱伤对健侧肢体的安全性及对患侧肢体功能恢复的有效性[7]。另外,课题组前期在对大鼠骶丛撕脱伤的研究中发现,脊髓前角神经元的死亡是影响修复效果的主要原因,因此研究脊髓前角神经元死亡的机制,对于提高脊髓前角神经元的存活率,改善骶丛撕脱损伤疗效有着关键作用。细胞死亡主要分为坏死和程序性的细胞死亡,而程序性细胞死亡又主要分为两种,I型为细胞凋亡,II型是自噬性细胞死亡,课题组前期实验已经证实骶丛神经撕脱后,脊髓前角神经元可发生明显凋亡,且脊髓前角神经元的凋亡随时间上升程度远不及其存活率下降程度[8],分析此过程可能存在自噬等其他细胞死亡方式。我们通过在体实验首次明确大鼠骶丛撕脱伤后脊髓前角神经元发生自噬并证实外源性HMGB1是其发生的诱因,另外,体外实验发现重组HMGB1可以诱导脊髓原代神经元发生自噬,HMGB1主要通过ERK和JNK通路对神经元自噬起调控作用,神经元的自噬在氧糖剥夺模拟的损伤环境下对其存活起保护作用[9]。本研究结果对骶丛神经根性撕脱伤这一病理生理过程提供了更为全面深入的认识,将有望提高骶丛撕脱伤后脊髓前角神经元的存活率,最终改善骶丛损伤修复疗效。第一部分健侧骶1神经根移位修复单侧骶丛神经撕脱伤的临床研究研究目的:评估健侧骶1神经根作为动力源神经移位修复单侧骶丛神经撕脱伤的安全性及有效性。实验方法:本研究纳入两组患者,第一组包括15例骶骨骨折伴有单侧骶丛神经损伤的患者,术前的体格检查、肌电图检查、磁共振及CT检查均证实患者健侧下肢的感觉运动功能完全正常,手术方法为腰4-骶4椎板减压及腰骶固定,同时对患者健侧的腰4-骶4神经根进行电刺激,记录下肢主要骨骼肌的动作电势,明确骶1神经根在下肢主要骨骼肌的神经支配情况。第二组包括6例单侧骶丛撕脱伤患者,手术方法为将健侧骶1神经根切断后与患侧臀下神经和坐骨神经股二头肌肌支吻合,同时取患侧的腓总神经做神经移植。实验结果:第一组结果显示骶1神经根主要参与臀中肌、臀大肌、股二头肌、腓骨长肌、腓肠肌内侧头、腓肠肌外侧头及趾短伸肌的神经支配,其对下肢主要骨骼肌的神经支配均可通过腰4,腰5,骶2和骶3神经根代偿,其神经支配所占比重最大为腓肠肌外侧头51.38%。第二组患者在术后均发现健侧足底的麻木及肌力的轻度下降,但这些症状逐渐消失,健侧肢体的神经电生理结果基本正常,但坐骨神经感觉诱发电位略降低,感觉定量检测可见患者在骶1神经根所支配的皮区上可见振动觉阈值明显升高,其余感觉未见明显差异。患侧髋外展肌力及膝关节屈曲肌力增加到Ⅲ级。结论:健侧骶1神经根移位修复单侧骶丛神经就临床评估和电生理检测结果来说是安全有效的。因此,骶1神经根是治疗单侧腰骶丛神经撕脱伤的合适动力源神经。第二部分大鼠骶丛神经撕脱伤后脊髓前角神经元自噬表达及机制研究研究目的:1、研究大鼠单侧骶丛撕脱伤后患侧脊髓前角神经元的自噬表达规律及其与外源性HMGB1关系。2、研究外源性HMGB1诱导大鼠原代脊髓神经元发生自噬及机制。3、研究HMGB1诱导自噬在损伤环境下对大鼠原代脊髓神经元的生物学意义。实验方法:1、选用成年雄性SD大鼠30只(体重200-220g),将其随机分为5组,每组6只,首先建立单侧腰4-腰6骶丛撕脱伤模型。分别于损伤后0小时,4小时,1天,3天,7天处死后取相应节段脊髓。分别观察以下指标:(1)利用透射电镜观察脊髓前角自噬小体等结构。(2)利用免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ及p62的表达情况。(3)利用免疫荧光法检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ及神经元特异性标记物Neu N的表达情况。再选用成年雄性SD大鼠10只(体重200-220g),将其随机分为2组,每组5只。A组:撕脱+对照Ig Y抗体组,B组:撕脱+HMGB1中和抗体组。A组首先在腹腔内注射对照Ig Y抗体(2μg/Kg),然后建立单侧腰4-腰6骶丛撕脱伤模型,B组首先在腹腔内注射HMGB1中和抗体(2μg/Kg),然后建立单侧腰4-腰6骶丛撕脱伤模型,均于损伤后1天处死取相应节段脊髓。分别观察以下指标:(1)利用酶联免疫吸附法检测血清中HMGB1表达情况。(2)利用免疫荧光法检测相应节段脊髓中HMGB1的表达情况。(3)透射电镜观察脊髓前角自噬小体等结构。(4)利用免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ及p62的表达情况。(5)利用免疫荧光法检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ及神经元特异性标记物Neu N的表达情况。2、(1)取培养第7天的SD大鼠原代脊髓神经元细胞,加入重组HMGB1(1μg/ml),分别于0小时、6小时、12小时、24小时、36小时和48小时,利用免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ及p62的表达情况,利用细胞免疫荧光法检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达情况。(2)取培养第7天的SD大鼠原代脊髓神经元细胞,加入重组HMGB1(1μg/ml),分别于0小时、3小时、6小时、12小时、24小时,利用免疫印迹法检测p-JNK,total-JNK,p-ERK,total-ERK,p-p38的表达情况。(3)取培养第7天的SD大鼠原代脊髓神经元细胞首先分别加入SB(10μM)、SP(20μM)和PD(20μM)处理1小时,然后加入重组HMGB1(1μg/ml)处理36小时,利用免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达情况。(4)取培养第7天的SD大鼠原代脊髓神经元细胞,A组:对照组,B组:HMGB1干预组,C组:氧糖剥夺干预组(1小时或4小时),D组:HMGB1+氧糖剥夺干预组(1小时或4小时),E组:HMGB1+氧糖剥夺(1小时或4小时)+氯喹干预组。cck-8活力测定检测神经元存活率。实验结果:1、单侧骶丛撕脱伤后患侧脊髓前角电镜下可见大量自噬小体,免疫印迹及免疫荧光检测均可见自噬相关蛋白高表达,撕脱伤后4小时和1天强度最高。A组血清及脊髓中HMGB1表达水平显著高于B组,电镜观察可见A组脊髓前角自噬小体数量大于B组,免疫印迹及免疫荧光检测均可见A组自噬相关蛋白表达水平高于B组。2、重组HMGB1显著提高原代脊髓神经元细胞的自噬相关蛋白表达,处理后36h表达最高。重组HMGB1激活原代脊髓神经元细胞ERK、JNK和p38 MAPK,ERK和JNK通路阻滞剂可降低自噬相关蛋白表达。HMGB1诱导的自噬在氧糖剥夺环境下提高细胞存活率,自噬阻滞剂氯喹预处理后显著降低细胞存活率。结论:单侧骶丛撕脱伤后患侧脊髓前角神经元发生自噬,撕脱伤后4小时和1天为表达最高。HMGB1中和抗体可显著降低骶丛撕脱伤后患侧脊髓前角神经元自噬表达。重组HMGB1可诱导原代脊髓神经元细胞的自噬表达,并通过ERK和JNK通路参与自噬调控。HMGB1诱导的自噬在损伤环境下对大鼠原代脊髓神经元起保护作用。