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真核细胞的核膜由内、外两层脂质膜组成,将细胞核从胞浆内分隔出来,形成具有独立功能的细胞器。依附于核内膜下的网状核纤层结构由核纤层蛋白及其相互作用蛋白复合物组成,这些蛋白复合物进一步延伸,在细胞核内形成网状结构,称为细胞核骨架。核纤层与核骨架共同为细胞核提供结构支撑,并且在维持正常细胞核功能中发挥重要作用。BCCIP通过与BRCA2、p21等多种功能蛋白相互作用,在细胞有丝分裂、细胞周期调控、DNA同源重组修复、基因组稳定性等方面起着重要作用。本论文研究采用免疫共沉淀和GST融合蛋白沉降技术(GST-pulldown),鉴定了 BCCIP与核纤层蛋白Lamim B1之间的蛋白相互作用。研究中还创新性地构建了 BCCIP条件性表达实验系统,并利用该系统深入探索了 BCCIP蛋白的全新功能,即在维持细胞核正常功能过程中的作用。实验结果1.构建了两种BCCIP条件性表达实验系统。(1)构建了 BCCIP条件性敲低细胞系(HT-CKD)。该细胞系整合了 U6-LoxP-Neo-LoxP-shRNA 转基因表达盒(transgene expression cassette),表达 Cre 重组酶可以实现HT-CKD细胞内BCCIP基因敲低(沉默);(2)分离构建BCCIP条件性敲除小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),该细胞含有纯和BCCIP基因条件性敲除等位基因(BCCIPFlox/Flox),表达Cre重组酶可以实现MEF细胞内BCCIP基因敲除;(3)与上述两系统相匹配,构建了多种Cre表达载体系统,包括H1P-Cre-HygroEGFP质粒载体,以及分别用于感染人类细胞和小鼠细胞的腺病毒和逆转录病毒。这些病毒可以在细胞内转导Cre重组酶或者带有Myc标签的Cre重组酶,并成功地实现了 HT-CKD细胞内BCCIP表达下调和MEF细胞内BCCIP条件性敲除。2.利用上述实验系统研究了 BCCIP的细胞生物学功能。(1)细胞内BCCIP表达缺陷导致生长抑制:(2)细胞内BCCIP表达缺陷导致染色质结构改变以及细胞核形态异常;(3)下调细胞内BCCIP表达水平导致核仁分布异常,同时造成RNA聚合酶Ⅱ(RNA pol Ⅱ)转录活性降低。3.BCCIP与Lamin B1相互作用的鉴定。(1)采用免疫共沉淀技术证明了 BCCIP与Lamin B1之间的相互作用;(2)GST融合蛋白沉降技术证明了 BCCIP与LaminB1蛋白之间的相互作用是直接的;(3)通过不完整蛋白片段表达的免疫共沉淀,进一步确认了 BCCIP蛋白通过其共有结构域(氨基酸残基168-258)与LaminB1结合;而LaminB1则通过其C末端免疫球蛋白样折叠结构域(氨基酸残基390-586)与BCCIP相互作用。4.BCCIP蛋白缺陷导致Lamin B1稳定性降低。(1)BCCIP表达缺陷导致细胞核膜区域LaminB1定位降低;(2)BCCIP表达缺失不影响LMNB1基因转录,其mRNA水平没有改变;(3)BCCIP表达缺陷导致LaminB1蛋白质稳定性降低,蛋白酶体抑制剂MG132(proteasome inhibitor)可以部分阻断BCCIP缺陷导致的Lamin B1降解。5.BCCIP shRNA抗性突变体在细胞内表达可部分恢复细胞生长抑制表型,尤其是BCCIP β蛋白亚型的表达。结论1.发现并确认了BCCIP与LaminB1间存在相互作用,两蛋白间的相互作用是直接的:确定了LaminB1与BCCIP的氨基酸残基168-258区域结合,BCCIP主要与LaminB1的C末端免疫球蛋白样折叠结构域氨基酸残基390-586结合。2.BCCIP的表达是维持Lamin B1依赖的细胞核功能所必需的。BCCIP表达缺失导致细胞生长抑制,同时伴随细胞核形状改变、核仁分布异常以及RNA转录活性降低等。3.BCCIP对维持Lamin B1的稳定发挥重要作用。BCCIP表达缺陷导致Lamin B1通过蛋白酶体-泛素化通路降解。