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【研究目的】肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝恶性肿瘤中最常见的病理类型,其进展快,恶性程度较高,预后较差,死亡率较高。HCC预后较差的主要原因是转移和复发。包括肝癌在内,肿瘤转移导致的相关死亡率为90%,因此对肝癌转移内在机制的深入研究有助于临床设计相关防治策略。相关研究表明,一些长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)调控一些关键分子在肿瘤转移中起重要作用。但目前为止,仍有大量未经研究的lncRNA可能与肿瘤转移有关,它们的作用也并不明朗。多能因子是保持细胞多潜能性和自我更新的核心基因,以OCT4,NANOG和SOX2最为关键,已有研究表明它们参与某些外界因子对肿瘤转移的调控。本研究旨在以肝细胞癌为切入点,找寻与肝癌转移相关的长链非编码RNA以及探究其与多能因子之间的关系,对肝癌细胞的影响。为进一步阐明肝癌转移的机制提供实验依据,为肝癌转移的干预与治疗提供可能靶点。【研究方法】首先我们通过lncRNA测序在肝癌原发灶与转移灶组织中找寻显著差异表达的lncRNA,随后通过生物信息学分析方法筛选与多能因子NANOG、OCT4、SOX2相关的差异表达lncRNA。接下来,采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测差异表达的lncRNA在人肝癌细胞系Hep3B、Huh7细胞及对应的肿瘤悬浮球中的表达量,发现仅有lncRNA-8439在肝癌细胞系以及其对应的悬浮球中差异表达,且表达差异最为显著。通过生物信息学分析我们预测lncRNA-8439可能与nanog结合。随后采用荧光原位杂交方法观察lncRNA-8439在Hep3B和Huh7细胞中的定位。利用转染过表达以及敲低lncRNA-8439,检测过表达以及敲低的效果。随后,敲低lncRNA-8439后,采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测2种肝癌细胞中NANOG的表达,并观察悬浮球生长情况。过表达lncRNA-8439后,采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测2种肝癌细胞中nanog的表达,并观察悬浮球生长情况。【研究结果】测序发现,显著差异表达的lncRNA共85条。对比原发灶肝癌组织,在转移灶肝癌组织中显著高表达的lncRNA共62条;对比原发灶肝癌组织,在转移灶肝癌组织中显著低表达的lncRNA共23条;从上述lncRNA中,通过生物信息学技术筛选出9个与多能因子NANOG、OCT4、SOX2相关的差异表达lncRNA;随后检测上述9个lncRNA在肝癌细胞系Huh7和Hep3B以及其相应的肿瘤悬浮球中的表达量。结果显示仅有lncRNA-8439在两种肝癌肿瘤悬浮球中呈一致上调或下调表达,与对应的细胞系表达量相比有统计学差异,且表达差异最为显著(P<0.01)。利用荧光原位杂交显示lncRNA-8439主要分布在胞核中;并发现lncRNA-8439可能与NANOG在3’端存在与结合的可能性;利用干扰RNA以及反向互补序列,成功在两种肝癌细胞系中干扰与过表达lncRNA-8439,为后续研究奠定实验基础。随后干扰及过表达实验显示,lncRNA-8439的表达能改变NANOG在分子水平以及蛋白水平的表达量,两者呈正相关关系。在此基础上将肝癌细胞进行悬浮培养发现,干扰lncRNA-8439使肝癌细胞悬浮球数量明显下降,过表达则产生相反结果。【结论】研究结果表明,lncRNA-8439在肝癌原发灶与转移灶组织中显著差异表达。lncRNA-8439能调控多能因子NANOG的表达,且影响肝癌细胞的自我更新能力,可能在肝癌的侵袭和转移中起作用。