卵转铁蛋白磷酸化修饰及其抑菌活性的研究

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卵转铁蛋白(OVT)约占蛋清蛋白质总量的12%,具有广谱的抗菌作用,其抑菌活性与其结构密切相关。本研究采用三聚磷酸钠对卵转铁蛋白进行修饰,以提高卵转铁蛋白的抑菌活性,并进一步探讨其构效关系及各因素对其抑菌活性的影响。主要研究内容和结果如下:1、采用三聚磷酸钠(STP)对卵转铁蛋白进行磷酸化修饰,以抑菌活性为评价指标,通过正交试验对修饰条件进行优化。试验结果表明,最佳修饰工艺条件为:pH值为9,OVT/STP为1g/10g,时间为1h,该条件下磷酸化的卵转铁蛋白(PP-OVT)的磷酸化程度为4.7%,并且对大肠杆菌的抑菌活性有极显著提高,对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活性有显著提高。2、构效关系:Zeta电位及等电点测定的结果表明磷酸化后卵转铁蛋白电位明显下降,电负性增加,且等电点发生酸性漂移:由pH5.39漂移至pH4.79;ANS荧光探针法测定蛋白表面疏水性的结果表明磷酸化后卵转铁蛋白的憎水基团暴露,表面疏水性显著提高;差示扫描量热法(DSC)分析结果表明磷酸化后卵转铁蛋白的变性温度由59.92℃提高到了66.67℃,热焓变值明显减小;荧光光谱分析结果表明磷酸化后卵转铁蛋白的荧光强度减弱,可见酪氨酸参与磷酸化反应使其微环境发生了改变;圆二色谱(CD)分析结果表明磷酸化后卵转铁蛋白的二级和三级结构都发生了变化。近紫外CD光谱表明酪氨酸参与了磷酸化反应;远紫外CD光谱表明α-螺旋、无规卷曲和β-转角结构均在减少,β-折叠结构在增加;拉曼光谱分析结果表明磷酸化使卵转铁蛋白引入了大量的磷酸根基团,并且卵转铁蛋白中的酪氨酸参与了磷酸化反应;卵转铁蛋白铁结合位点上阴离子的引入、分子结构的展开以及β-折叠结构的增加,都使得卵转铁蛋白可以更容易与铁离子结合,从而提高了其抑菌活性。3、体外抑菌试验表明:磷酸化后卵转铁蛋白对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的MIC和MBC均减小;偏酸偏碱性、高浓度的盐、高温环境都对卵转铁蛋白抑菌活性影响较大,但磷酸化后卵转铁蛋白的抑菌活性受pH、阳离子浓度、温度的影响变小。
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