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白叶枯病和细菌性条斑病(简称细条病)是对水稻最具破坏性的两种病害。控制病害最经济有效的措施就是种植抗病品种。目前,已至少发现40个抗白叶枯病基因,其中克隆了9个;但克隆的大多数的抗性基因存在抗性弱、抗病育种进展缓慢,真正有生产利用价值的基因很少。目前还未从水稻中克隆出一个细条病抗性基因,只在栽培稻和野生稻中发现一些细条病的抗性资源,但抗谱窄。因此,目前培育广谱抗白叶枯病与细条病的水稻是水稻抗病育种工作面临的重大难题。并且基因工程快速培育广谱抗病水稻的植株也大都带有筛选标记,无法进行产业化。本研究拟利用前期获得的受白叶枯病菌和细条病菌诱导表达的人工启动子,并且在建立的无标记转基因系统策略的基础上,构建含人工启动子的Xa23和Xa27的双右边界载体,通过转基因,采用常规分子鉴定与田间抗性鉴定手段,获得了无标记的双抗白叶枯病与细条病转基因水稻,且通过转基因T1的分子鉴定与抗性调查分析,证实抗性确实是由转基因引起,并可稳定遗传。主要研究结果如下:1.成功构建了两个用于水稻转化的植物表达载体pMDRBBIN6-Xa23和pMN RBBIN6-Xa23和pMN DRBBIN6-WXa23.2.利用农杆菌转化系统分别将pMNDRBBIN6-Xa23和pMDRBBIN6-WXa和3转入台北309水稻愈伤组织中,经过多次筛选、分化分别得到再生植株21株和33株。将再生植株移栽于稻田,并对T0代转基因植株进行表型及分子鉴定,PCR检测获得pMNDRBBIN6-Xa23阳性植株为20株,pMNDRBBIN6-WXa23阳性植株为27株。3.分别对转pMNDRBB和pMDRBBIN6-WXa23的T0代植株,进行了结实率,千粒重、穗长、株高、单株分蘖数5个主要农艺性状进行了考查。结果显示:两种转基因水稻穗长、株高、单株分蘖数、千粒重与TP309对照相比均无显著差异性,结实率与TP309对照相比发生了改变,但经分析得出并非是由于转基因所引起,有可能是由组培、种植环境等因素影响。4.从pMNDRBBIN6-Xa23转基因水稻T0代PCR分子鉴定和抗性分析比较好的植株上收获种子,选取16个抗病株系进行T1代转基因材料的种植,共493株。再分别用TaleXa23引物和Hpt引物进行PCR鉴定,并统计PCR结果。从TaleX a23引物结果中,pMNDRBBBN6-Xa23转基因植株共统计482株,阳性植株为394株,阳性检出率为81.7%。其中有6个株系基本符合3:1孟德尔遗传分离定律。从Hpt引物结果中,pMNDRBBIN6-Xa23转基因植株共统计482株,阳性植株为360株,阳性检测率为74.7%;pMNDRBIN6-WXa23转基因植株共统计180株,阳性植株为100株,阳性检测率为55.6%。以上结果说明pMNDRBBIN6-Xa23和pMNDRBBIN6-Xa23基因可以稳定遗传。5.分别对转pMNDRBBIN6-Xa23和pMNDRBBIN6-WXa23的T1代植株16和13个株系,共493株和368株,分别接种白叶枯病菌和细条斑病菌进行抗性鉴定。结果显示:与TP309对照组相比,转pMNDRBBIN6-Xa23T1代植株均一定程度提高了对白叶枯病P6和细条病Xoc的抗性。pMNDRBBIN6-WXa23对细条病Xoc表现为感病,而对其白叶枯病P6抗性分析时,其基本表现为感病,分析可能为转基因中某些基因的沉默而大部分表现为感病,只有极少数表现为抗病。6.分别对其T1代转基因pMNDRBBIN6-Xa23植株筛选出用潮霉素引物(Hpt)检测为阴性,特异引物(TaleXa23)检测为阳性的抗性植株(即为无标记转基因植株)。结果筛选出pMNDRBBIN6-Xa231-4株系1株,pMNDRBBBIN6-Xa23 1-5株系 1 株,pDRB-Xa23 2-3株系 1 株,pMNDRBBIN6-Xa21 株系7株,pMNDRBBI N6-Xa23 3-2株系3株,pMNDRBBIN6-Xa23 3-3株系1株 pMNDRBBIN6-Xa23 3-5株系7株,共21株无标记转基因植株。7.分别选表型及分子鉴定比较好的代表性的抗性株系以及无标记的抗性植株,TP309为对照;对其分别接种无菌水,白叶枯病菌P6和细条病Xoc后用实时荧光定量PCR检测外源基因的表达情况,结果显示:在接种P6和Xcc的叶片中,Xa23基因的表达量与其接无菌水以及对照TP309接无菌水,P7和Xoc的表达量具有极显著差异(p<0.05),说明Xa23基因是受白叶枯病菌P6和细条病Xoc诱导表达的,筛选出了无标记的具有双抗白叶枯病和细条病的植株。