背景：二肽基肽-4(DPP4)抑制剂可以保护心血管系统。有研究表明,造血干细胞(HSC)的激活与慢性压力对脑和心血管疾病的发生有密切关系。根据心理情志和免疫系统之间的相互作用,为探究压力和疾病的发生和发展提供了内在联系,以及压力致病机理提供了研究方向,我们运用慢性应激模型,聚焦于论证慢性压力激活造血干细胞(HSC),进而引起一系列的过激免疫应激反应而危害心脑血管系统。DPP4抑制剂,通过GLP1/GLP1R介导的Adrβ3/Cxcl12信号通路,可以改善BM中HSC的过度活化。目的：基于心理情志和免疫系统之间的潜在联系,为连接慢性应激和疾病的发生和发展奠定了基石,我们聚焦于DPP-4抑制剂,寻求DPP4抑制剂改善慢性应激的不良反应的理论依据——即,DPP-4抑制剂是通过对ADRβ3/CXCL12依赖介导的GLP-1/GLP-1R轴的抑制,而抑制骨髓造血干细胞(HSC)的活化,从而减轻外周血炎症因子的聚集引起的炎症反应。材料与方法：实验使用8周龄的雄性小鼠(C57BL/6J,体重21-25g)随机分组进行慢性应激实验(2小时两次/天；7天/周)正常饮食,给予慢性压力的小鼠又随机分成3组,不给药组和给予DPP4抑制剂的低剂量或高的剂量(10或30毫克/kg/2次/日)。此外,对于应激实验中的小鼠投与艾塞那肽(10微克/kg/2次/日)。未接受慢性应激的小鼠作为对照。实验还使用了DPP4基因敲除的大鼠(DuCrj)和对照组(F344/JCL),并对其随机分组,一组未接受慢性应激作为对照组,一组进行慢性应激实验(2小时两次/天；7天/周)正常饮食。压力实验过程中记录了体重(BW),收缩压(SBP),舒张压(DBP),和心率(HR),并测了血浆中的葡萄糖,尿素氮,非酯化脂肪酸( NEFA),肌酐,高密度脂蛋白(HDL),低密度脂蛋白(LDL),血清天冬氨酸转氨酶(AST),甘油三酯(TG),总胆固醇(TCH),多巴胺(DA),去甲肾上腺素(NA)和肾上腺素(A)。用ELISA评价血浆水平基质衍生afactor-1 (SDF-1)和胰高血糖素样蛋白-1(GLP-1)。检测外周血的白血细胞(WBC),红细胞(RWC),血小板,血红蛋白(Hb)的,平均红细胞血红蛋白(MCV),平均红细胞体积(MCH),嗜中性粒细胞,嗜酸性粒细胞和单核细胞。小鼠和大鼠骨髓切片进行了H&E染色和免疫染色(包括BrdU, Ki67+/Sca-1+, Ki67+/ c-kit+).使用DPPIV-GloTM蛋白酶分析试剂盒测血液以及组织(包括脑,肌肉,肝,肠,肾,内脏脂肪,主动脉,肺和心脏)中DPP4的蛋白活性。流式细胞仪(FACS)分析以评价小鼠骨髓：c-kit+/Sca-1+, CD48-/CD150+s等造血干细胞的指标,以及细胞周期分析细胞周期(G0-G1期,S期,G2期,M期)；评价小鼠末梢血：CD45+高表达白细胞,中性粒细胞,Ly6C高表达单核细胞,Ly6C阴性的巨噬细胞,CD4+/CD8+高表达T淋巴细胞等,运用明胶酶谱法施检测基质金属蛋白酶2和9的活性。免疫组织化学染色/免疫荧光染色、免疫蛋白印迹(Western Blot)多种检测方法揭示DPP-4的抑制剂可以调控慢性压力诱导激活的HSC的增殖。结果：与对照组相比,小鼠慢性压力后皮下脂肪和腹股沟脂肪减少甚至消失,压力组小鼠体重明显降低,肾上腺素和去甲肾上腺素,而血浆甘油三酯也明显降低了,而SBP以及血浆NEFA明显增加。然而,血浆中LDL,HDL,葡萄糖,AST,BUN和肌酸的水平,在对照组和压力组之间没有存在统计学意义上的差异。1.慢性压力可以增加血浆和各组织中的DPP4活性。使用DPPIV-GloTM蛋白酶分析试剂盒,检测对照组和慢性应激组的血液和组织(包括脑,肌肉,肝,脾,小肠,皮下脂肪,内脏脂肪,肾,肺和心脏)中DPP4活性。我们观察到对照组小鼠(脑,心脏,肺,脾,小肠,皮下脂肪,内脏脂肪,肾和肝)的组织中以及血液中的DPP4活性处于低水平。而压力组与预期结果一致,进行4w慢性压力后,血液和其他组织(除了肝组织以外,脑,肾,肌肉等)DPP4的活性显著增加；在DPP4活性变化中,变化最高的表现为大脑——(小鼠大脑中DPP4活性与对照组相比增加了10倍；大鼠大脑中DPP4活性与对照组相比增加了20倍),这就表明受压后极有可能由大脑首先接受压力刺激或对压力刺激接受最为敏感,而DPP4可以通过血脑屏障,自然成为了如实反应压力刺激的担当。对大脑的石蜡切片进行H&E染色,显示其结构图(增刊图S2a中)。使用CD26抗体(CD26是DPP4其中一个别名)的免疫染色显示,我们观察到慢性应激导致在大脑中CD26阳性表现的增强。我们对实验对照组和压力组的DPP4活性进行定时监测——即,分别在压力实施后1w,2w,3w,4w测定两组大鼠血液中的DPP4活性,在血液中DPP4的活性随着压力时间的增加而增加,这表明增加的DPP4活性与压力存在正相关的关系。此外,血浆中GLP-1和SDF-1的水平与对照小鼠相比压力组小鼠的显著降低。2.慢性应激活化炎症细胞和HSC的增殖。探索压力与白细胞增高的关系以及促使其增高后的不良影响。对实验小鼠进行4周应激,运用小动物末梢血检测仪检测其末梢血。与对照组相比,压力组小鼠血液中白细胞,中性粒细胞和单核细胞明显增加,这与以前的临床自然医学杂志的研究报道相吻合。接下来我们通过流式细胞仪(FACS)测定这些炎症细胞(中性粒细胞,单核细胞和巨噬细胞)在骨髓中亦显著增多。另外,我们通过FACS也对慢性应激对造血干细胞的增殖和细胞周期的影响进行了研究。细胞周期包括G0-G1期,S期,G2期,M期四个期。G1期,指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；S期(synthesi s phase),指DNA复制的时期；G2期,指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；M期又称D期(mitosis or division),细胞分裂开始到结束。S/M/G2属于细胞增殖期,应激组小鼠骨髓细胞S/M/G2期百分比明显增高,说明应激后细胞处于增殖期。造血干细胞的指标Lin-c-kit+/Sca-1+,CD48+/CD150+的增多,表明造血干细胞的增多。骨髓石蜡切片使用H&E常规染色和BrdU免疫组织化学染色,压力组小鼠的BrdU阳性细胞明显增加。收集4周应激小鼠和对照组的BM细胞进行细胞培养。4天后分别进行Sca-1+/ Ki67+,PCNA+/CD 150+双重免疫荧光染色,双阳性细胞明显增加。表明压力诱导BM中的HSC的增殖。探索应激诱导HSC增殖的细胞机制,我们收集实验小鼠的大脑和BM蛋白和RNA样本,应用Western和RT-PCR检测GLP-1受体(GLP-1R)和Adrβ3蛋白质的表达以及CXCL12的基因表达。压力小鼠脑中的GLP-1R蛋白的表达和CXCL12基因表达明显降低；而骨髓细胞的Adrβ3蛋白的表达显著增加。运用Gelatin zymography(基质金属蛋白酶活性的代表性检测分析法明胶酶谱频),定量分析显示,压力组BM细胞中基质金属蛋白酶9(MMP9)的活性明显增加。最近各别研究表明在慢性受压后交感神经的活化和BM的CXCL12的抑制之间存在密切联系。与这些研究报道相符合的是,我们检测的血浆中GLP-1和SDF-1的水平,压力小鼠比对照小鼠相比显著降低。因此,压力状态下,白细胞的增多极有可能通过GLP1/GLP1R介导的Adrβ3/ Cxcl12信号通路,与BM中HSC活化联接起来。3.DPP4抑制剂抑制应激诱导的HSC的活化,使应激诱导的HSC的增殖减少。进一步探索DPP4调控应激诱导HSC活化的机制,我们于小鼠接收压力3天前给予小鼠低或高剂量阿格列汀的DPP4抑制剂治疗(即DL组和DH组)。实验表明,阿格列汀口服给药28天后,对收缩压和BW压力后无统计学意义上的影响。抑制DPP4也对肾和肝功能血脂和其他参数(葡萄糖和游离脂肪酸除外)没有统计学意义上的影响。与预期结果一致,阿格列汀几乎完全压制血液和局部脑组织DPP4活性。更令人惊喜的是DPP4抑制剂显著抑制应激诱导增加的肾上腺素和去甲肾上腺素。在BM通过流式细胞仪对HSC的增殖和炎症细胞的产生进行分析,Lin-c-kit+/Sca-1+, CD48+/CD150+的减少表明造血干细胞减少；同时也抑制了骨髓中单核细胞,巨噬细胞和嗜中性粒细胞的表达。与压力组相比,这些细胞在治疗组中显著减少。FACS的细胞周期实验和BrdU免疫组化染色结果表明,与压力组相比,给予DPP4抑制剂治疗的小鼠BM中S/M/G2期百分比明显降低以及BrdU+(PCNA+/CD150+)双阳性细胞也显著减少。运用末梢血检测仪检测其末梢血,我们发现给予DPP4抑制剂治疗的小鼠的外周血中单核细胞,巨噬细胞和嗜中性粒细胞的表达也明显低于压力组。实验表明,应激诱导的HSC的活化是与DPP4的增高密切相关的,使用DPP4抑制剂可以缓解应激诱导的HSC过度增殖作用。自然医学杂志有报道作为交感神经的激活和信号传导极为可能响应于应激,是与Adr03和CXCL12变化紧密相关的。我们应用western来检测相关的蛋白表达,检测了脑中GLP-1R以及骨髓中Adrβ3的蛋白活性,发现DL组和GH组脑中GLP-1R蛋白水平明显增高,骨髓中Adrβ3显著减少。运用RT-PCR,检测到DL组和GH组小鼠骨髓中CXCL 12的mRNA水平明显升高。这表明DPP4抑制剂可以改善慢性压力诱导的骨髓干细胞的增殖和GLP-1R, Adr(33蛋白表达以及CXCL 12的基因表达。运用Gelatin zymography,定量分析显示,如预期结果一致,DL组和DH组与压力组相比MMP9的活性明显降低。DPP4的抑制使BM中的MMP9活性降低了。ELISA数据显示DPP4的抑制促使SDF-1和GLP-1的降解受到抑制并伴随DPP4活性的降低而升高。慢性应激会引起血中DPP4浓度明显增高,从而引起脑中GLP一1R活性的降低,促使骨髓中Adrβ3的活性升高,CXCL12的表达降低,过度激活HSC的增殖,诱发一系列炎症反应,以保护脑损伤。因此,我们的结论是,使用DPP4抑制剂,通过GLP1/GLP1R介导的Adrp3/CXCL12信号通路,进而改善BM中HSC的过度活化,从而减轻血循环中单核/巨噬细胞的聚集,中性粒细胞的浸润而引起的全身持续性炎症恶性循环。4.GLP-1激动剂通过GLP1/GLPIR介导的Adrβ3/CXCL12信号通路改善应激诱导的HSC过度增殖。为了检验这一假设,我们给予小鼠GLP-1R激动剂艾塞那肽治疗,观察GLP-1R激动剂对应激诱导的HSC增殖的影响。压力3天前,对随机分组的其中一组压力小鼠每日两次给予GLP-1R激动剂艾塞那肽(皮下注射)治疗(即GLP-1R组)。于压力后第28天,收集实验小鼠的骨髓和血液样本进行FACS和免疫染色。与压力组相比,接受激动剂治疗的小鼠LKSs和造血干细胞的数量显著降低,同样,PCNA+/CD150+双阳性细胞明显减少,以及S/M/G2的百分比也相应降低。此外,接受艾塞那肽治疗小鼠的骨髓Adrβ3染色结果亦显示其阳性表现明显降低。Western免疫印迹分析表明,脑中的GLP-1R表达水平,接受激动剂治疗的小鼠明显增加。而,Gelatin zymography分析显示,接受激动剂治疗的小鼠,BM细胞中MMP9的活性水平显著减少了。因此,GLP-1R的激动剂经由Adrβ3活化和MMP9活性度的降低,以改善HSC过度增殖的反应。此外,接受激动剂治疗的小鼠与对照组小鼠之间的其他研究的参数(除了血浆中NEFA和葡萄糖以外)没有统计学意义的差异。使用GLP-1受体激动剂,通过GLP1/GLP1R介导的Adrp3 Cxcl12信号通路,进而改善BM中HSC的过度活化,从而减轻血循环中单核/巨噬细胞的聚集,中性粒细胞的浸润而引起的全身持续性炎症恶性循环。5.DPP4的活性调控HSC的增殖。 为了进一步阐明DPP4活性助于HSC活化,我们在束缚应激模型中使用DPP4+/+和DPP4-/-大鼠。与DPP4抑制剂组一致,DPP4基因缺陷组血浆肾上腺素和去甲肾上腺素水平明显降低。与对照组DPP4+/+大鼠相比,DPP4-/-大鼠血浆中GLP-1明显升高。正如预期的预测那样,DPP4基因缺陷组抑制骨中造血干细胞增殖的过度的应激反应。此外,DPP4基因缺陷组伴随HSC细胞在骨髓的减少,PCNA+/CD150+双阳性细胞明显降低。DPP4缺陷组血中性粒细胞也显著降低。同样地,Western免疫印迹分析表明,在脑中的GLP-1R蛋白的水平明显升高；RT-PCR定量分析显示,CXCL12的基因表达亦明显升高,而免疫组化染色中Adrβ3的阳性表达显著降低(如图7G-i)。此外,DPP4-/-组大鼠的血样生化检测中血浆NEFA和葡萄糖明显降低,而基因缺陷组大鼠与对照组大鼠之间的其他研究的参数没有统计学意义的差异。DPP4基因缺陷组大鼠,由于DPP4的缺陷,通过GLP1/GLP1R介导的Adrβ3/ Cxcl12信号通路,进而改善BM中HSC的过度活化。结论：DPP4活性于应激下血循环和大脑中增高,提倡无创伤性检测血液中的DPP4活性,可以作为应激状态下产生的一种特异性新型的生物标记物。此外,我们探明了DPP4通过GLP-1/GLP-1R介导的Adrβ3/ CXCL12信号通路调控的造血干细胞的增殖活性。从而,提出了DPP4-GLP1/GL P-1R轴可作为应激性造血干细胞活化及其相关心血管疾病疾病的新的治疗靶点。当然这一观点还需要大规模临床试验加以验证。