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背景和目的肝肺综合征(hepatopulmonary syndrome,HPS)是一种慢性肝病的晚期并发症,主要临床症状为难治性低氧血症。据临床资料统计,肝肺综合征在肝硬化患者中发病率为4-29%。目前,HPS的发病机制研究已取得一定的成果,但仍然未完全阐明,且临床转化治疗还需进一步开展。其中,血管异常扩张、动静脉分流、氧合功能障碍是HPS的主要病理表现,这些变化通常引起肺血管重建,从而加速肺部病理的恶化进程。肺微血管异常扩张的病理机制是HPS中的研究热点,在我们团队的前期研究中发现,血管的异常扩张可能与肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs)的异常增殖有关,而在另一方面,我们发现HPS病人在进行肝移植手术后,肺微血管阻力明显升高,表明肺微血管存在收缩反应,而在正常情况下,肺微血管是不具备这一特性的,血管的异常扩张无法完全用PMVECs的异常增殖来进行解释,因此可能存在其他的病理机制。在前期实验,采用HPS大鼠血清对PMVECs进行刺激培养,随后发现PMVECs中肌性相关蛋白SM-α-actin、calponin、SM-MHC的表达水平显著上调,这些结果提示PMVECs在HPS血清病理条件下发生了肌样分化,因此具有收缩特性。在先前的研究报道中,骨形态发生蛋白2(Bone morphogenic protein-2,BMP-2)在细胞的增殖、分化及迁移中起重要调节作用,但是其在PMVECs肌样分化中的作用还不太明确。因此本研究拟证实HPS血清通过上调BMP-2/Smad信号通路引起PMVECs发生肌样分化。方法1.构建HPS大鼠模型并制备血清,培养大鼠原代PMVECs;检测HPS大鼠血清对PMVECs肌样分化的影响本课题的HPS大鼠模型采用胆总管结扎法(chronic bile duct ligation,CBDL)进行构建,模型构建28天之后,采集动脉血进行血气分析,随后取肺组织和肝组织进行HE染色,最后收集并制备正常血清和HPS血清备用。采用组织块法培养原代PMVECs,组织化学法进行内皮细胞特异性抗原鉴定。将第3代PMVECs在含5%HPS血清的内皮培养基中培养0h、24h、48h和72h后,观察PMVECs形态的变化情况,同时检测肌性相关蛋白SM-a-actin,caplonin,SM-MHC的表达变化。2.检测HPS大鼠血清对PMVECs中BMP-2/Smad信号通路的影响将PMVECs分为正常血清组(C组)和HPS血清组(HPS组),分别采用含5%正常血清或5%HPS血清的DMEM培养基培养PMVECs 24 h、48 h和72h,各个时间点后采用RT-PCR和western blot检测各组PMVECs中BMP-2转录水平和蛋白表达水平。同时采用western blot检测各组不同时间点PMVECs中BMP-2下游关键蛋白Smad1/5及P-Smad1/5蛋白水平。3.检测人重组蛋白Noggin对HPS血清介导PMVECs肌样分化的影响。采用BMP-2抑制剂人重组蛋白Noggin预处理,检测在不同血清刺激培养72h后,PMVECs中Smad1/5及P-Smad1/5蛋白水平的变化。并检测肌性相关蛋白SM-a-actin,caplonin,SM-MHC表达的变化。4.检测Smurf-1依耐性Smad1/5蛋白降解对HPS血清调控PMVECs中BMP-2/Smad通路活性的影响将PMVECs分为正常血清组(C组)和HPS血清组(HPS组),分别采用含5%正常血清或5%HPS血清的DMEM培养基培养PMVECs 24 h、48 h和72h,各个时间点后采用western blot检测各组PMVECs中Smurf-1蛋白表达变化。之后,采用si RNA下调PMVECs中Smurf-1的表达水平,分别检测不同血清刺激培养72h后,PMVECs中Smad1/5及P-Smad1/5蛋白水平的变化。并进一步采用蛋白酶体抑制剂MG132处理PMVECs后,分别检测在不同血清刺激培养72h后,PMVECs中Smad1/5及P-Smad1/5蛋白水平的变化。结果1.HPS大鼠血清促进PMVECs的肌样分化在倒置显微镜下观察:C组培养PMVECs多呈现为梭形。而HPS组培养PMVECs多呈现为呈长梭形,与C组形态相差巨大。在HPS血清刺激之前,PMVECs内未检测SM-α-actin、calponin、SM-MHC等蛋白表达,而HPS血清刺激24h、48h、72h后,PMVECs内SM-α-actin、calponin、SM-MHC蛋白表达增加(P<0.05),呈时间依耐性。2.HPS大鼠血清激活PMVECs中BMP-2/Smad信号通路相比C组,HPS组PMVECs内BMP-2 m RNA及其蛋白表达显著增加(P<0.05),呈时间依耐性;同时,BMP-2下游关键分子Smad1/5及P-Smad1/5蛋白水平显著增加(P<0.05),呈时间依耐性;3.人重组蛋白Noggin部分抑制HPS血清介导PMVECs肌样分化的进程人重组蛋白Noggin能显著抑制HPS血清介导BMP-2/Smad信号通路的活化,并抑制PMVECs中肌性蛋白SM-α-actin、calponin的表达(P<0.05),但对SM-MHC的表达没有影响(P﹥0.05)。4.HPS血清抑制Smurf-1介导的Smad1/5降解,促进BMP-2/Smad信号通路的过度激活相比C组中各时间点,HPS组PMVECs内Smurf-1蛋白表达显著下降(P<0.05),呈时间依耐性;在HPS血清刺激下,si RNA-Smurf-1和MG132能进一步抑制PMVECs内Smad1/5的降解,促进BMP-2/Smad的活化。结论本研究表明HPS大鼠血清诱导的PMVECs内BMP-2及其m RNA表达增强,而其下游的Smad1/5异常激活与HPS血清诱导的Smurf-1下调有关。采用人重组蛋白Noggin抑制BMP-2/Smad的活化,能部分逆转PMVECs的肌样分化进程。