木聚糖酶广泛应用于食品、饲料、能源、纺织和造纸等工业中，然而，由于其在天然材料中表达水平低、活性差、热稳定性低以及生产成本高等因素，严重限制了它的推广应用。反刍动物瘤胃中含有大量能分泌木聚糖酶的微生物，然而通过纯培养技术分离得到的微生物种类极少。本实验室通过构建湖羊瘤胃微生物Fosmid文库筛选到一个酶活性较好的木聚糖酶克隆，通过测序分析，发现其含有调控碳水化合物代谢的开放阅读框（Open reading frame，ORF）6、7和30，其中ORF6编码一个与产琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes）S85产生的β-D-1,4-内切木聚糖酶相似度为61％的内切木聚糖酶。对ORF6所编码的蛋白质进行三级结构预测，发现其含有一个催化结构域（Catalytic domain，CD）和一个未知区域(Unkonwn domain，UN)，这两个区域由一段连接肽（Linker peptide，LP）连接在一起。为了满足饲用木聚糖酶的工业生产需要、开发半纤维类生物能源，本研究采用体外定向进化技术改良该木聚糖酶的催化活性，结合酵母表面展示技术构建相应的全细胞木聚糖酶以提高木聚糖酶的热稳定性，并通过体外瘤胃发酵实验对全细胞木聚糖酶的应用性能进行评估，主要结果如下:　　1.UN的木聚糖结合能力分析本研究克隆了木聚糖酶基因orf6中编码未知区域的基因un，获得重组大肠杆菌UN。将UN与包含未知区域的木聚糖酶基因orf6及不含未知区域的木聚糖酶基因orf6-un的重组大肠杆菌HB2和HA2一起进行原核表达。亲和层析纯化后，对HA2、HB2和UN的木聚糖结合能力进行Native-PAGE分析。结果显示，HA2、HB2和UN均无木聚糖结合能力，说明UN不是木聚糖结合域。　　2.木聚糖酶基因orf6-un的体外定向进化UN不具有木聚糖结合力，且其存在会降低木聚糖酶的比活力，为此，选取不含未知区域的木聚糖酶基因orf6-un作为定向进化的基因材料。首先，利用易错PCR(error-prone PCR，EP-PCR)产生随机突变，然后采取96微孔板结合DNS法筛选木聚糖酶催化活性提高的优势突变体。第一轮EP-PCR后共筛选1450个转化子得到一个酶活性提高的克隆C12。将C12的基因作为亲本进行第二轮EP-PCR，共筛选2500个转化子得到3个酶活性提高的克隆，其中酶活性最高的克隆是E12。纯化后的野生型酶HA2、突变体酶C12和E12的比活力分别为59.02 U/mg、68.03 U/mg和120.30 U/mg。酶学特性分析发现，HA2、C12和E12的最适温度均为50℃，但是C12、E12的热稳定性低于HA2。HA2和C12的最适pH均为5.0，E12的最适pH为6.0，三者的催化活性在pH小于5.0或者大于8.0条件下显著下降。pH稳定性研究结果表明，三者在pH5.0-9.0的条件下均能保持约85％的活性。与HA2相比，C12有2处氨基酸发生突变（Q14H和K57R），这导致其Km值和kcat值分别下降78％和77％，催化效率(kcat/Km)提高1.06倍。第二轮EP-PCR后，E12在C12的基础上又多了2处氨基酸突变（V20A和M53I），这使得其催化效率(kcat/Km)进一步提高9％。三维结构分析发现，M53I替换使酶内核部分的疏水性增加，它可以避免内核与水分子的结合，增加催化活性中心与底物的结合机会，这可能是E12催化效率提高的原因。　　3.全细胞木聚糖酶的构建采用酵母表面展示技术，构建野生型全细胞木聚糖酶(Whole-cell xylanase，WCX)和突变型全细胞木聚糖酶(Whole-cell xylanase mutant，WCXm)。首先，克隆木聚糖酶基因orf6-un（亲本型）和orf6-unm（突变型），将其插入pYD1构建穿梭质粒，然后采用PEG/LiAc法转化酿酒酵母EBY100，获得重组酿酒酵母工程菌。在无氨基酵母氮源-酸水解酵素(YNB-CAA)培养基中，采用2％半乳糖诱导使木聚糖酶展示于酵母表面。利用免疫荧光检测和酶活检测确认全细胞木聚糖酶的正确表达后，通过冷冻干燥，得到粉末状的全细胞木聚糖酶。酶学性质研究发现，WCX和WCXm的最适温度均为50℃，在50℃孵育30min，能保持约80％的酶活性，在90℃孵育30 min，能保持约40％的酶活性，与原核表达的相应木聚糖酶(HA2和E12)相比，热稳定性提高，说明酵母表面展示技术有助于提高木聚糖酶的热稳定性。　　在各自的最适条件下测定全细胞木聚糖酶的酶活，经鉴定，WCX的酶活性为28 U/g（指每克细胞干重的木聚糖酶酶活为28 U），WCXm的酶活性为33U/g。　　4.全细胞木聚糖酶对体外瘤胃发酵的影响本研究以玉米秸秆为底物，采用体外瘤胃发酵技术评估全细胞木聚糖酶的应用效果。试验采用单因子试验设计，设置4个处理组，分别为空白对照组、EBY100组、WCX组和WCXm组，底物为干物质含量0.5 g的玉米秸秆，培养液为50 ml体积1∶9的瘤胃液和人工唾液，各处理按照2g/L培养液的水平添加，每个处理设置4个重复。体外试验瘤胃液取自3只安装永久性瘤胃瘘管的湖羊。培养结束后，利用DNS法分析瘤胃微生物酶活，采用绝对定量PCR技术分析瘤胃微生物主要菌群的数量变化，借助代谢组学分析技术研究瘤胃微生物代谢产物的变化，以初步探讨全细胞木聚糖酶影响瘤胃发酵的机理。　　体外瘤胃发酵结果显示:WCXm从第3h开始就显著增加了产气量(P＜0.05)，WCX和EBY100从第6h开始显著增加产气量(P＜0.05)，且二者之间差异不显著（P＞0.05）;全细胞木聚糖酶和EBY100的添加均显著提高了发酵液乙酸、丙酸、丁酸和总挥发酸的含量以及氨态氮（Ammonia nitrogen，NH3-N）的浓度（P＜0.05），其中添加WCXm的效果显著优于EBY100和WCX（P＜0.05）;全细胞木聚糖酶的添加显著提高了干物质降解率(Dry matterdegradation，DMD)(P＜0.05)，而EBY100对DMD的影响不显著(P＞0.05)。以上结果表明全细胞木聚糖酶对瘤胃发酵具有促进作用，并且WCXm的效果优于WCX。　　瘤胃微生物酶活分析结果显示:与对照组相比，EBY100的添加显著增加了瘤胃微生物木聚糖酶、纤维素酶和羧甲基纤维素酶的酶活(P＜0.05);全细胞木聚糖酶中只有WCXm的添加显著增加了纤维素酶酶活(P＜0.05)。　　荧光定量结果显示:与对照组相比，全细胞木聚糖酶和EBY100的添加显著增加了总菌、白色瘤胃球菌的数量（P＜0.05），显著减少了黄色瘤胃球菌的数量(P＜0.05)，对真菌的数量均没有显著影响(P＞0.05);EBY100的添加显著增加了产琥珀酸丝状杆菌的数量（P＜0.05），全细胞木聚糖酶对产琥珀酸丝状杆菌的数量没有显著影响(P＞0.05)。　　代谢组分析结果显示:EBY100、WCXm和对照组之间的瘤胃微生物代谢有明显的差异。差异性代谢产物分布在多个代谢途径上，选取涉及碳水化合物代谢途径、能量代谢途径、脂质代谢途径的差异性代谢产物进行分析。涉及碳水化合物代谢途径的差异性代谢产物有50个，分布于13个代谢通路;涉及能量代谢途径的差异性代谢产物有26个，分布于6个代谢通路;涉及脂质代谢途径的差异性代谢产物有42个，分布于14个代谢通路。在这3个代谢途径中，EBY100的添加下调的差异性代谢产物个数多于上调，WCXm的添加上调的差异性代谢产物的个数多于下调，且多于EBY100。以三羧酸循环为中心比较WCXm与EBY100涉及碳水化合物代谢途径中的部分差异性代谢产物，发现WCXm的添加优化了碳水化合物代谢途径，进而促进了瘤胃发酵，这表明WCXm的添加对瘤胃发酵的促进作用仅部分来源于EBY100。