论文部分内容阅读
目的：通过研究愈肝颗粒对肝纤维化大鼠肝组织中Smad4、Smad7蛋白分布与量的影响，结合肝功能、肝纤维化血清学指标及病理的检测，探索愈肝颗粒抗实验性大鼠肝纤维化的疗效及作用机制。
方法：Wistar大鼠90只随机分为9组，分别为正常对照四、六、八周组；模型对照四、六、八周组；愈肝颗粒四、六、八周组。用0.5％二甲基亚硝胺(Dimethylnitrosamine，DMN)按每次0.2ml/100g的剂量进行腹腔注射(共10次)复制成肝纤维化模型，正常对照组用等体积生理盐水腹腔注射。实验第四周末，处死全部四周组动物。从实验第五周起，愈肝颗粒组给予愈肝颗粒浸膏0.55ml/100g灌胃(相当于成人临床用药剂量的6.5倍)，1次/天。正常对照组及模型对照组用清洁自来水0.55ml/100g灌胃，1次/天。分别于第六、八周末处死模型对照组和愈肝颗粒组的六、八周组动物，收集血清及肝组织作标本，作肝功能ALT、AST、ALB及肝纤维化血清学指标透明质酸(Hyaluronicacid，HA)、层粘连蛋白(Laminin，LN)的检测，病理切片观测肝组织病理学变化并进行肝脏炎症活动度和纤维化程度计分，作Smad4和Smad7的免疫组织化学染色观察其表达的量及分布的变化，并用图像分析软件对它们表达的阳性区域面积(Positivearea，PA)及光密度(Opticaldensity，OD)进行半定量分析。
结果：(1)造模情况：①正常对照四周组与正常对照八周组比较：ALT、AST、ALB、HA、LN、肝组织炎症活动度和纤维化程度计分、Smad4和Smad7的PA和OD值比较，P＞0.05。病理切片显示两组肝组织的肝小叶结构都正常，未见炎性细胞浸润及肝细胞坏死，无纤维组织增生。免疫组化显示：Smad4在两组的肝细胞内都无表达，在Disse间隙、汇管区及非实质细胞内可见少量表达，Smad7只在两组的肝细胞胞质内明显表达。故实验时的腹腔注射、灌胃、抓取等处理因素对造模无影响。②模型对照四周组与正常对照四周组比较：模型对照四周组ALT、AST、HA、LN、肝组织炎症活动度和纤维化程度计分明显升高，ALB明显降低，以上均P＜0.01。肝脏炎症坏死及纤维化明显。免疫组化Smad4阳性区域增宽，在门静脉和中央静脉周围、纤维间隔及炎性细胞中广泛分布，PA和OD值明显增高；而Smad7阳性区域明显减少，着色浅淡，只在少数肝细胞及扩大的纤维间隔内的梭状细胞内分布，PA和OD值也明显降低。以上P值＜0.01，差异有显著性。③模型四周组分别与模型六、八周组比较显示：AST、ALT、ALB、肝组织炎症活动度、纤维化计分，均P＞0.05。HA、LN随造模时间延长增高，在八周组最高，P值均＜0.01。肝组织病理改变显示：六周组炎症坏死最明显，八周组炎症活动度减轻，而纤维化程度在三组间差异不大。免疫组化显示：六周组Smad4阳性染色区域最广，伴染色团块状增强，在肝细胞中也有少量表达，PA最高，P＜0.01，Smad4、Smad7其余各组的PA和OD的P值均＞0.05。
(2)愈肝颗粒治疗情况：①愈肝颗粒六周组与四周组的比较：AST、ATL、HA、LN和肝组织炎症活动度和纤维化程度计分显著降低，P＜0.01，但ALB恢复不显著，P＞0.05。病理切片显示：肝脏炎症及坏死减轻，纤维间隔变细，肝小叶结构紊乱减轻。免疫组化中Smad4表达减少，着色变浅，主要位于门脉系统纤维间隔和肝小叶之间的非实质细胞，其PA及OD值均降低，而Smad7表达明显增多，着色变深，主要分布在肝细胞胞质中，其PA及OD值也增加，以上P值均＜0.01，差异有显著性。②愈肝颗粒八周组与六周组比较：ALT、AST、HA、LN和肝组织炎症活动度和纤维化程度计分继续降低，以上均P＜0.05，ALB也有所增加，但P＞0.05。病理切片示：炎症、坏死病变基本消失，纤维化进一步减少，肝组织结构已基本正常。免疫组化中Smad4的表达继续减少，着色浅淡，PA及OD值更低；Smad7阳性染色区域继续增加，有颗粒状着色，肝细胞质内表达丰富，部分肝细胞核膜也有表达，PA及OD值更高，以上P位均＜0.01，差异有显著性。③正常对照八周组与愈肝颗粒八周组的比较：ALT、AST、ALB基本恢复正常，P值大于0.05，差异无显著性。但HA、LN和炎症活动度和纤维化程度仍较正常组高，P＜0.05。病理改变显示：愈肝颗粒8周组炎症、坏死病变基本消失，只在汇管区和中央静脉周围仍然有少量胶原纤维增生，但肝小叶结构已基本正常。免疫组化中Smad4的PA仍较正常组多，P值＜0.01，但OD值已恢复正常，P＞0.05；Smad7表达面积及着色浓度仍较正常组少，PA及OD值仍低，P值均＜0.01，差异有显著性。
结论：①DMN腹腔注射能成功诱导大鼠肝纤维化模型，形成的肝纤维化模型较为稳定，且病理改变类似人类的乙型肝炎，是研究肝纤维化发病与治疗的较理想的模型之一。②Smad4/Smad7表达失衡及分布异常是造成大鼠肝纤维化的重要机制之一。③愈肝颗粒治疗肝纤维化效果显著，能明显恢复肝功能，降低肝纤维化血清学指标，在病理上减轻肝脏炎症坏死及肝纤维化，使Smad4表达减少，Smad7表达增高，并使二者分布趋于正常。④愈肝颗粒治疗肝纤维化对肝功能、肝纤维化指标、病理、Smad4和Smad7蛋白的远期疗效明显优于近期疗效。⑤愈肝颗粒治疗大鼠肝纤维化取得较好的疗效，与其下调Smad4，上调Smad7，重建R-Smad/I-Smad平衡有关。