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研究背景血红素加氧酶(heme oxygenase, HO)是血红素分解代谢过程中的限速酶，人体内的CO主要是由血红素加氧酶(HO)代谢产生。HO有三种类型：诱导型(HO-1)、组成型(HO-2)及尚未明确的HO-3[1]。研究表明，HO-1不仅在机体生理状态下发挥作用，更主要是在机体其他非正常状态/应激状态下发挥作用。HO-1参与活性氧、活性氮、缺血、细菌脂多糖、血红素等诱导的氧化应激反应。研究显示HO-1表达升高可减轻应激损伤大鼠的脑组织形态与氧化应激损伤程度，其机制可能与Nrf2-Keap1［(NF-E2-relatedfactor2,转录因子NF-E2相关因子2)-(Kelch-likeECH－associated protein1,胞浆蛋白伴侣分子)］和PI3K/Akt/GSK-3β(phosphatidyllinositol-3-kinase/Akt/glycogen syntheses kinase-3β,磷脂酰肌醇激酶-3/丝苏氨酸蛋白激酶/糖原合成酶激酶-3β)通路有关[2-3]。血红素在HO-1作用下分解为胆红素、游离铁离子和CO，这些物质参与自由基的清除、炎症因子的抑制释放、转录激活因子的上调、tau蛋白的磷酸化和抑制HO-1的泛素化等病理生理过程[4-7]。HO-2主要分布在中枢神经系统及睾丸，它所产生的CO在神经信号传递中起重要作用，与CO发挥神经递质的作用密切相关；HO-2维持脑的正常生理功能，而HO-1与神经系统疾病密切相关。一氧化氮合酶(nitric oxide syntheses, NOS)有三种同工酶，包括主要存在于神经系统中的神经型一氧化氮合酶(nitric oxide syntheses, nNOS)，存在于巨噬细胞、肝细胞和神经胶质细胞中的诱导型一氧化氮合酶(nitric oxidesyntheses, eNOS)和主要存在于内皮细胞中的内皮型一氧化氮合酶(nitricoxide syntheses, iNOS)。在生物体内，NOS利用L-精氨酸和分子氧作为底物，NADPH辅酶作为辅助因子，经过一系列氧化反应生成一氧化氮(NO)和瓜氨酸。在神经系统中NO作为一种重要的信号分子，参与了学习与记忆等重要的神经生理活动，同时对脑部血流具有调节作用，并参与神经系统的免疫防御。另一方面过量的NO又生产细胞毒性氧化物质(如氮自由基、过氧亚硝酸盐等)，与脑缺血损伤、痴呆、帕金森病等疾病的发生、发展有密切关系。因此，在正常生理条件下，神经系统中存在着从时间与空间上精确调控NO产生、释放、扩散与灭活的机制，而这主要是通过调控nNOS的活化与去活化实现的。研究证明nNOS通过与CB2(type2cannabinoidreceptor,大麻素受体2)结合直接调节nNOS，进而与抗氧化蛋白Hsp70和抗凋亡蛋白Bcl-2共同完成CB2通路，延迟神经退行性变[8]。一氧化氮合酶调节体内一氧化氮自由基和氧自由基平衡[9]，参与脑创伤后损伤及神经再生、缺血再灌注损伤、神经系统退行性疾病、脑卒中、精神分裂性疾病等病理生理过程[10-13]，其机制与脂质过氧化、蛋白质羰基化、蛋白硝基化和自由基清除有关[14-15]。Ríos R等[16]探讨低浓度砷中毒性大鼠中枢损害模型发现，不仅活性氧与脂质过氧化产物可作为氧化应激损伤的生物学标志，nNOS也可作为氧化应激损伤的生物学标志之一。姜黄素(curcumin, Cur)是姜科植物Curcuma longa根茎中分离得到的一种脂溶性多酚类化合物，具有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤、抗纤维化、保护心血管系统和消化系统等功能[17-18]。近来研究发现在神经退行性疾病和各种脑功能紊乱疾病中有起到防治作用[19-20]，并证实Cur能保护多种细胞免受H2O2诱导的氧化损伤[21-22]。但关于Cur对神经细胞氧化应激损伤的保护作用机制的探讨相对较少[23-24]。如前所述，HO-1与nNOS在一些病理状态下与氧化应激损伤存在着密切关联，因此，本实验采用H2O2诱导海马神经元氧化应激的损伤模型，观察Cur对HO-1、nNOS的影响，探讨Cur抗氧化应激损伤的保护作用机制，为Cur的临床应用提供理论依据。目的：探讨姜黄素对氧化应激损伤海马神经元的保护作用机制，为姜黄素的临床应用提供一些理论依据。方法：分离新生SD大鼠(≤24h)的海马，采用Neurobasal+2％B27无血清原代培养海马神经元，倒置相差显微镜观察海马神经元生长情况、检测神经元纯度，MTT法检测神经元活性，NeuN、NF-200进行神经元鉴定。培养至10d，将细胞分为6组：空白对照组、损伤组、姜黄素处理组(2.5μmol/L、5.0μmol/L、10.0μmol/L、20.0μmol/L)。等体积H2O2(1mmol/L)处理海马神经元1h，建立氧化应激损伤模型；用DMEM/F12轻洗2次，姜黄素各处理组分别加入浓度为2.5μmol/L、5.0μmol/L、10.0μmol/L、20.0μmol/L的姜黄素培养液300μl，空白对照组和损伤组分别加入无血清培养基300μl，培养孵育6h后利用倒置相差显微镜观察细胞变化，MTT法测定各组神经元活性，乳酸脱氢酶比色法和硫代巴比妥酸法测定LDH活力和MDA浓度，免疫组化和免疫荧光测定海马神经元HO-1、nNOS的表达，RT-PCR测定HO-1、nNOS的mRNA表达。结果：1.海马神经元接种在培养板上3~4h细胞贴壁，第1d细胞长出突起，第7~8d细胞突触生长迅速，第9~11d细胞交织成网状，细胞生长旺盛；20d后细胞轴突缩短、断裂、胞体无光晕。利用无血清培养基和差速贴壁方法培养的神经元纯度可达92%。MTT法检测较其他各时间点的神经元活性，9~11d的海马神经元活性较高，P <0.05，利于海马神经元氧化应激损伤模型建立。2.倒置相差显微镜观察海马神经元氧化应激损伤模型(1h)，细胞突触粘附力降低，部分细胞漂浮，轴突粗糙、断裂，细胞内可见空泡。3.6h后倒置相差显微镜下观察各组细胞，5.0μmol/L组、10.0μmol/L组细胞形态与1h时比较无明显变化；2.5μmol/L组、20.0μmol/L组轴突缩短比1h时明显，但轴突无断裂、胞体仍有光晕；损伤组细胞轴突缩短、断裂、胞体光晕减低比1h时更明显、数量更多；空白对照组细胞轴突完整、光滑、交织成网状、胞体光晕强度与1h时无变化。4. MTT检测5.0μmol/L组和10.0μmol/L组较损伤组神经元活力明显增高，P <0.05；较损伤组，空白对照组神经元活力更强，P <0.05；5.0μmol/L组和10.0μmol/L组神经元活力与2.5μmol/L组、20.0μmol/L组神经元活力比较，差异有统计学意义，P <0.05；2.5μmol/L组、20.0μmol/L组较损伤组神经元活力比较，差异无统计学意义，P>0.05。5. LDH活力检测5μmol/L组和10μmol/L组与损伤组比较LDH活力降低，P <0.05；损伤组与空白对照组比较LDH活力增强，P <0.05；5.0μmol/L组和10.0μmol/L组LDH活力与2.5μmol/L组、20.0μmol/L组LDH活力比较，差异有统计学意义，P <0.05；2.5μmol/L组和20.0μmol/L组与空白对照组比较LDH活性降低，P <0.05。6. MDA浓度检测5.0μmol/L组和10.0μmol/L组与损伤组比较MDA浓度降低，P <0.05；损伤组与空白对照组比较MDA浓度升高，P <0.05；5.0μmol/L组和10.0μmol/L组MDA浓度与2.5μmol/L组、20.0μmol/L组MDA浓度比较，差异有统计学意义，P <0.05；2.5μmol/L组和20.0μmol/L组与空白对照组比较MDA浓度升高，P <0.05。7.免疫组化、免疫荧光、PCR检测与损伤对照组比较，5.0μmol/L组、10.0μmol/L组HO-1表达升高，nNOS表达降低，P <0.05；损伤组与空白对照组比较HO-1表达下降，nNOS表达升高，P <0.05；5.0μmol/L组和10.0μmol/L组HO-1、nNOS的表达与2.5μmol/L组、20.0μmol/L组比较差异有统计学意义，P <0.05；2.5μmol/L组、20.0μmol/L组与损伤组比较HO-1、nNOS的表达，差异无统计学意义，P>0.05。结论：1.浓度为5μmol/L和10μmol/L的姜黄素可升高氧化应激损伤海马神经元HO-1的表达、降低nNOS的表达，表现出对神经元一定程度的保护作用；2.脂质过氧化参与了H2O2诱导的海马神经元的氧化应激性损伤，姜黄素处理组5μmol/L和10μmol/L可降低神经元的脂质过氧化，减少神经元LDH的释放，反映出对神经元细胞膜的保护作用。