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日本血吸虫病是由日本血吸虫成虫寄生于人和哺乳动物的肠系膜下静脉而引起的严重危害人类健康的传染性疾病。从尾蚴侵入到虫卵排出均可对宿主造成损害,最主要的致病虫期为虫卵。虫卵能沉积在宿主结肠壁和肝脏等组织的小静脉内,通过释放可溶性虫卵抗原(soluble egg antigen,SEA)而引起组织出现肉芽肿并继发纤维化。其致病机制为辅助性T细胞(helper T cell,Th)介导的ⅣV型超敏反应。研究证实,Th2细胞、Th17细胞和滤泡辅助性T细胞(Follicular helperT cell,Tfh)可分别分泌特异性的细胞因子白介素4(interleukin-4,IL-4)、IL-17和IL-21发挥促进虫卵肉芽肿和纤维化形成的作用,而Th1细胞和调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)则通过分泌功能性细胞因子干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)和IL-10起相反的抑制作用。Th9细胞是一种新的Th细胞亚群,有研究发现Th9细胞参与了乙肝纤维化的发生发展过程,并在CC14诱导的小鼠肝纤维化过程中起到促进作用,但Th9细胞在日本血吸虫病引起的虫卵肉芽肿和继发的肝纤维化过程中是否发挥作用尚未阐明。ICOSL/ICOS信号与Th细胞的分化与极化密切相关。已有研究表明,该信号通路对Th2、Th17和Tfh细胞的极化具有调节作用,从而影响日本血吸虫病虫卵肉芽肿以及纤维化等免疫病理变化的发生和发展。但ICOSL/ICOS信号通路对Th9细胞的极化是否同样发挥调节作用还未见报道。本研究应用日本血吸虫尾蚴感染小鼠建立日本血吸虫病实验动物模型,通过特异性的增强ICOSL/ICOS信号通路观察该通路对Th9细胞分化和极化的影响;以及通过体内和体外实验探索Th9细胞与肝纤维化发生和发展之间的相关性;此外,通过探讨Th9与Th2不同的免疫应答特征,为进一步阐明日本血吸虫病肝纤维化发生的分子机制提供科学依据,为有效控制血吸虫病虫卵肉芽肿病变和抑制纤维化的发生提供新思路。一、日本血吸虫感染小鼠免疫病理过程中Th9及IL-9的动态变化目的:探讨宿主感染日本血吸虫后Th9细胞增殖分化的特征及其免疫调节作用。方法:应用HE染色法制作病理切片,观察并分析日本血吸虫尾蚴感染小鼠前(0周)以及感染后4周、7周、9周和12周肝脏虫卵肉芽肿的病理变化趋势;应用免疫组织化学方法观察并检测感染前后不同时期肝脏虫卵肉芽肿周围IL-9和转录因子PU.1的表达水平;应用流式细胞术分析不同感染时期的小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞中Th9细胞所占的比例;应用酶联反应吸附法检测不同感染时期的小鼠血清中细胞因子IL-9的表达水平。结果:HE染色结果显示,小鼠感染日本血吸虫后第4周出现虫卵肉芽肿,在第7周肉芽肿面积最大,随后逐渐减小;免疫组织化学法结果显示IL-9与PU.I在肝脏虫卵肉芽肿周围的表达水平在感染后4周即显著增加并于第7周达到最高水平,随后缓慢下降;流式细胞术检测结果显示小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞中Th9细胞的比例从感染后4周明显增高,感染后7周达到峰值,9-12周逐渐降低;酶联反应吸附法检测小鼠血清中IL-9的表达水平趋势与流式细胞术检测Th9细胞的趋势一致。结论:感染日本血吸虫后,小鼠Th9细胞及IL-9水平明显增加,且动态变化趋势与肝脏虫卵肉芽肿体积的变化趋势一致,表明Th9细胞及其细胞因子IL-9参与了日本血吸虫病的免疫应答并与虫卵肉芽肿的发生发展相关。二、Th9细胞在日本血吸虫病虫卵肉芽肿反应及肝纤维化形成中的作用目的:探讨宿主感染日本血吸虫后,Th9细胞及其细胞因子IL-9在肝脏虫卵肉芽肿和纤维化的发生发展过程中发挥的作用。方法:1.将18只小鼠随机分为3组:对照组、anti-IL-9组和IgG组。对照组为正常小鼠,anti-IL-9组为感染日本血吸虫尾蚴小鼠且感染后每周两次经腹腔注射100 ug anti-IL-9抗体,IgG组为感染日本血吸虫尾蚴小鼠且每周两次经腹腔注射100 ug IgG抗体。日本血吸虫感染后9周,分别应用流式细胞术检测各组小鼠脾淋巴细胞中Th9细胞的比例,ELISA测定各组小鼠血清中IL-9的浓度,HE染色方法和Masson染色法观察并分析肝脏虫卵肉芽肿的病理变化以及肝脏组织内胶原面积的变化情况。2.采用在体原位肝脏灌注法和密度梯度离心技术,分离感染前小鼠和日本血吸虫尾蚴感染7周后小鼠的原代HSCs。体外培养24小时后,将HSCs分为对照组和刺激组,对照组在DMEM完全培养基中培养,刺激组在含20ng/ml IL-9的DMEM完全培养基中培养,分别于刺激后的48小时和72小时收集细胞,用Western blotting技术分析检测HSCs中α-SMA、Collagen-Ⅰ和Collagen-Ⅲ蛋白的表达水平。结果:感染9周后anti-IL-9组和IgG组小鼠肝脏均出现明显的虫卵肉芽肿性炎症和纤维化病变。但与IgG组相比,体内阻断IL-9后小鼠肝脏脾淋巴细胞中Th9细胞的比例以及血清中IL-9的浓度显著下降,并且肝脏虫卵肉芽肿病变和纤维化程度均明显减轻。体外IL-9诱导实验结果显示,在感染前(0周)和感染后7周,分离的原代HSCs经IL-9体外刺激后α-SMA、Collagen-1、Collagen-Ⅲ蛋白的表达水平均明显高于对照组。结论:Th9/IL-9可促进日本血吸虫感染小鼠肝纤维化的发生和发展,其调控机制可能是通过激活HSCs来实现的。三、日本血吸虫病免疫病理进程中Th9先于Th2发挥免疫调节作用目的:探讨Th9与Th2细胞在日本血吸虫病免疫病理进程中相互之间的免疫网络调节效应。方法:应用流式细胞术检测日本血吸虫尾蚴感染小鼠前(0周)以及感染后4周、7周、9周和12周脾脏CD4+ T淋巴细胞中Th9细胞和Th2细胞所占的比例的变化趋势;应用酶联反应吸附法检测不同感染时期的小鼠血清中细胞因子IL-9和IL-4的表达水平;应用免疫组织化学方法观察并检测感染不同时期小鼠肝脏虫卵肉芽肿周围炎症细胞中IL-9和IL-4的表达水平。结果:流式细胞术检测结果显示小鼠感染日本血吸虫后脾淋巴细胞中Th9细胞的比例从第4周开始明显增高并在7周达到峰值,9-12周逐渐下降。Th2细胞则在感染后持续上升,直到12周达到峰值;ELISA与流式细胞术以及免疫组织化学结果保持一致,在小鼠血清和肝脏组织中IL-9的表达的峰值出现在感染后7周,IL-4表达的峰值则出现在感染后12周。结论:在日本血吸虫病的免疫病理过程中,Th9/IL-9可能比Th2/IL-4更早的发挥免疫调节作用。四、ICOSL/ICOS信号通路在小鼠日本血吸虫病免疫病理进程中对Th9细胞和Th2细胞的调控作用目的:探讨ICOSL/ICOS共刺激信号对小鼠日本血吸虫病致病过程中Th9细胞和Th2细胞分化增值的免疫调控作用。方法:应用流式细胞术检测日本血吸虫尾蚴感染前(0周)以及感染后4周、7周、9周和12周ICOS-Tg小鼠及其野生型对照小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞中Th9细胞和Th2细胞所占的比例;应用ELISA检测不同感染时期ICOS-Tg小鼠及其野生型小鼠血清中细胞因子IL-9和IL-4的表达水平;应用免疫组织化学方法观察并检测不同感染时期的ICOS-Tg小鼠及其野生型小鼠肝脏虫卵肉芽肿IL-9和IL-4的表达水平。结果:流式细胞术检测结果显示,日本血吸虫感染后ICOS-Tg小鼠与其野生型小鼠相比,Th9细胞在4周、7周和9周显著增高,Th2细胞在7周和9周明显上调;ELISA结果显示,日本血吸虫感染后ICOS-Tg小鼠血清中IL-9在4周、7周、9周和12周的表达以及IL-4在7周的表达显著高于感染同期野生型小鼠;免疫组织化学结果显示,日本血吸虫感染后ICOS-Tg小鼠肝脏中IL-9在4周、7周、9周和12周的表达以及IL-4在7周、9周和12周的表达均明显高于同期野生型对照小鼠。结论:上调ICOSL/ICOS信号通路可促进日本血吸虫病免疫应答过程中Th9细胞和Th2细胞的分化和增殖。本研究结果表明:Th9细胞极化在日本血吸虫病免疫病理过程中发挥着重要的作用,Th9细胞及其功能因子IL-9能促进日本血吸虫病肉芽肿和肝纤维化发生和发展。通过特异性的增强或减弱ICOSL/ICOS信号通路可调控Th9细胞的极化,从而为有效控制血吸虫病肉芽肿和肝纤维化病变以及防止晚期肝硬化的发生发展提供新思路。