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目的：1.研究己糖激酶抑制剂3-溴丙酮酸（3-bromopyruvate，3-BrPA）对乳腺癌细胞增殖及死亡的影响。2.研究3-BrPA诱导乳腺癌细胞死亡是否为Caspase依赖性的。3.探讨3-BrPA与z-VAD-fmk合用诱导乳腺癌细胞产生的坏死性凋亡是否为RIP1/RIP3依赖性的。4.探讨3-BrPA与z-VAD-fmk合用诱导乳腺癌细胞产生的坏死性凋亡是否为MLKL依赖性的。5.探讨肿瘤坏死因子α在乳腺癌细胞对3-BrPA与z-VAD-fmk合用诱导坏死性凋亡敏感性中的作用。方法：1. MTT法检测药物处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231及MDA-MB-435后对细胞存活率的影响。2. ATP检测试剂盒检测不同浓度3-BrPA（80,160,320μmol·L-1)处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231及MDA-MB-4356h后细胞内ATP水平。3.集落形成实验检测药物对细胞集落形成的影响。4.溴化丙啶（propidium iodide，PI）单染法及Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测药物处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231及MDA-MB-43524h后对细胞存活率的影响。5.电镜观察药物处理细胞后细胞亚显微结构的变化。6. Western blot法检测药物处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231对坏死性凋亡相关蛋白RIP1、RIP3、MLKL、TNF-α及ΤΝFR1表达的影响。7. Real-time PCR检测药物处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231后坏死性凋亡相关蛋白RIP3及TNF-α信使RNA表达量的变化。8.利用siRNA技术下调RIP1，RIP3，MLKL和TNFR1观察细胞对药物诱导其发生坏死性凋亡敏感性的变化。结果：1.不同浓度3-BrPA对人乳腺癌细胞MDA-MB-231及MDA-MB-435增殖及死亡的影响1.1MTT实验结果显示不同浓度3-BrPA (20，40，80，160，320μmol·L-1)对人乳腺癌细胞MDA-MB-231有增殖抑制作用，且随着3-BrPA浓度的增加和作用时间的延长，对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖抑制作用也不断增强，而MDA-MB-435细胞对此浓度下的3-BrPA不是很敏感。1.2为进一步观察3-BrPA对人乳腺癌细胞MDA-MB-231及MDA-MB-435的增殖抑制作用，实验中根据MTT实验结果，使用明显低于MDA-MB-231细胞半数抑制浓度的30，40，50μmol·L-1的3-BrPA刺激细胞，使用集落形成实验检测3-BrPA对人乳腺癌细胞MDA-MB-231及MDA-MB-435增殖抑制作用的影响。结果表明：低剂量浓度的3-BrPA对MDA-MB-231细胞具有增殖抑制作用，而MDA-MB-435细胞对此不是很敏感。1.3ATP实验结果显示，3-BrPA (80，160，320μmol·L-1)对两株乳腺癌细胞内的ATP生成均起到抑制作用，且呈浓度依赖性。1.43-BrPA (80，160，320μmol·L-1)处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231、MDA-MB-43524h，PI单染法检测结果显示：随着3-BrPA浓度的增加，MDA-MB-231细胞的死亡率逐渐增多，而MDA-MB-435细胞的死亡率无明显变化。Annexin V-FITC/PI双染法结果与单染法所得结果一致。2. z-VAD-fmk与3-BrPA联用诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231发生坏死性凋亡2.1用160μmol·L-13-BrPA，10μmol·L-1z-VAD-fmk以及二者合用处理MDA-MB-231细胞24h；用500μmol·L-13-BrPA，10μmol·L-1z-VAD-fmk以及二者合用处理MDA-MB-435细胞24h，使用结晶紫染色后，结果显示：z-VAD-fmk可加速3-BrPA在MDA-MB-231细胞中诱导的细胞死亡，而对3-BrPA在MDA-MB-435细胞中诱导的细胞死亡起明显的保护作用。MTT实验也显示了相同的实验结果。2.2我们进一步使用电镜观察药物处理后两株乳腺癌细胞亚显微结构的变化，结果显示：对照组MDA-MB-231细胞胞浆均匀，胞膜完整；而使用160μmol·L-13-BrPA和10μmol·L-1z-VAD-fmk联合处理的MDA-MB-231细胞出现了细胞器肿胀，细胞膜完整性消失，细胞内容物外泄等坏死性凋亡的特征。与此同时，对照组MDA-MB-435细胞胞浆均匀，胞膜完整；使用320μmol·L-13-BrPA处理的MDA-MB-435细胞内有自噬泡的出现。这提示MDA-MB-435细胞对相对低浓度的3-BrPA不敏感可能是由于细胞发生了自噬。3. MDA-MB-231细胞发生坏死性凋亡依赖于RIP1和RIP3的表达3.1用坏死性凋亡抑制剂Necrostin-1（10μmol·L-1）处理发生坏死性凋亡的MDA-MB-231细胞，使用结晶紫染色后，结果显示，Necrostin-1对发生坏死性凋亡的MDA-MB-231细胞具有明显的保护作用。MTT实验也显示了相同的实验结果。3.2Western blot结果显示：在MDA-MB-231细胞中，联合使用160μmol·L-13-BrPA和10μmol·L-1z-VAD-fmk处理组RIP1的表达量较对照组，3-BrPA组及z-VAD-fmk组明显升高。3.3Real-time PCR结果显示：在MDA-MB-231细胞中，联合使用160μmol·L-13-BrPA和10μmol·L-1z-VAD-fmk处理组RIP3信使RNA的表达量较对照组，3-BrPA组及z-VAD-fmk组明显升高。3.4用RIP1siRNA预处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231，24h后，Western bolt检测RIP1表达量明显降低。沉默RIP1的表达后，用160μmol·L-13-BrPA和10μmol·L-1z-VAD-fmk联合处理MDA-MB-231细胞24h，使用MTT法检测其存活率，并与对照组相比较。实验结果显示：与对照组相比，RIP1siRNA预处理后，3-BrPA与z-VAD-fmk合用诱导MDA-MB-231细胞产生的坏死性凋亡被明显抑制。3.5用RIP3siRNA预处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231，24h后，Western bolt检测RIP3表达量明显降低。沉默RIP3的表达后，用160μmol·L-13-BrPA和10μmol·L-1z-VAD-fmk联合处理MDA-MB-231细胞24h，使用MTT法检测其存活率，并与对照组相比较。实验结果显示：与对照组相比，RIP3siRNA预处理后，3-BrPA与z-VAD-fmk合用诱导MDA-MB-231细胞产生的坏死性凋亡一定程度被抑制。4.下调MLKL表达可降低MDA-MB-231细胞对3-BrPA与z-VAD-fmk合用诱坏死性凋亡的敏感性4.1Western blot结果显示：在MDA-MB-231细胞中，联合使用160μmol·L-13-BrPA和10μmol·L-1z-VAD-fmk处理组MLKL的表达量较对照组，3-BrPA组，z-VAD-fmk组明显升高。4.2通过MTT检测发现，使用MLKL抑制剂NSA可保护3-BrPA和z-VAD-fmk在MDA-MB-231细胞中诱导的坏死性凋亡。4.3用MLKL siRNA预处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231，24h后，Western bolt检测MLKL表达量明显降低。沉默MLKL的表达后，用160μmol·L-13-BrPA和10μmol·L-1z-VAD-fmk联合处理MDA-MB-231细胞24h，使用MTT法检测其存活率，并与对照组相比较。实验结果显示：与对照组相比，MLKLsiRNA预处理后，3-BrPA与z-VAD-fmk合用诱导MDA-MB-231细胞发生的坏死性凋亡一定程度被抑制。5.3-BrPA和z-VAD-fmk对MDA-MB-231细胞中肿瘤坏死因子α表达的影响5.1Real-time PCR结果显示：在MDA-MB-231细胞中，联合使用160μmol·L-13-BrPA和10μmol·L-1z-VAD-fmk处理组TNF-α信使RNA的表达量较对照组，3-BrPA组及z-VAD-fmk组明显升高。5.2Western blot结果显示：在MDA-MB-231细胞中，联合使用160μmol·L-13-BrPA和10μmol·L-1z-VAD-fmk处理组TNF-α的表达量较对照组，3-BrPA组及z-VAD-fmk组明显升高。5.3MTT实验结果显示，使用TNF-α抑制剂后，3-BrPA与z-VAD-fmk合用诱导MDA-MB-231细胞发生的坏死性凋亡一定程度被抑制，且随着TNF-α抑制剂浓度的增加，坏死性凋亡率降低。细胞形态学图片也验证了相同的实验结果。5.4用TNFR1siRNA预处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231，24h后，Western bolt检测TNFR1表达量明显降低。沉默TNFR1的表达后，用160μmol·L-13-BrPA和10μmol·L-1z-VAD-fmk联合处理MDA-MB-231细胞24h，使用MTT法检测其存活率，并与对照组相比较。实验结果显示：与对照组相比，TNFR1siRNA预处理后，3-BrPA与z-VAD-fmk合用诱导MDA-MB-231细胞发生的坏死性凋亡一定程度被抑制。结论：1. z-VAD-fmk可以增强3-BrPA诱导MDA-MB-231细胞死亡。2.自噬可能是MDA-MB-435细胞对相对低浓度3-BrPA不敏感的原因之一。3.3-BrPA与z-VAD-fmk合用诱导MDA-MB-231细胞发生的坏死性凋亡是RIP1，RIP3，MLKL和TNFR1依赖性的。