听力损失是世界上最常见的感觉障碍疾患,直接影响到患者的生活质量,目前被认为是一个主要的公共健康问题。年龄相关性听力下降(Age-related heating loss,AHL)或老年性聋(presbycusis)是指听觉系统老化而引起的耳聋。它不仅与听觉系统衰老的生理和病理变化相关,还与遗传因素以及人体在过去的生命历程中所经受的各种刺激因素、社会环境等因素有关。临床共同特点是由高频向语频缓慢进行的双侧对称性聋,常伴有高调持续性耳鸣。迄今为止,仍然没有被普遍接受的有效治疗方法。所以,其病因学研究对于预防耳聋的出现和指导治疗具有非常重要的临床意义和社会意义。随着遗传学与分子生物学的发展,遗传因素与老年性聋发病的关系越来越受到重视,近年来,在基因背景以及基因检测方法上有较多的研究。 实验目的： 探讨建立D-半乳糖致豚鼠衰老模型的方法,检测每组豚鼠的听阈变化,并应用扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)技术检测与听力损失相关的分子生物学指标,为进一步揭示老年性聋发病机制及其防治策略提供参考依据。 实验方法： 1.动物分组及处理58只豚鼠(广东省实验动物中心提供)采用抽笼法随机分为3组,A组(模型老化组,25只),5％D-半乳糖腹腔注射200mg-kg-1·d-1,共6周；B组(模型对照组,18只),给予相同剂量生理盐水注射。再将A、B两组豚鼠置于噪音环境中7天,每天8小时。C组(空白对照组)15只,不予以任何处理。 2.听功能的检测：运用听性脑干反应(auditory brainstem responses,ABR)进行豚鼠听阈检测,每组豚鼠同步检测听阈三次,分别在给药前后及噪音暴露后。 3.取每只豚鼠肝及脑组织,测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性及丙二醛(maleic dialdehyde,MDA)水平。 4.组织学观察：取豚鼠小块肝和脑组织立即放入10％的中性甲醛液中固定,作常规取材、石蜡包埋、切片、HE染色,镜下观察。 5.提取内耳组织DNA,应用AFLP技术进行分子生物学检测。 6.结果统计： 统计学处理所有数据以(x±s)表示,用SPSS 11.5软件进行统计学分析。根据方差齐性(Homoscedasticity)与否,选择应用t检验或t检验进行均数比较。 结果： 1.听阈改变 用药前,三组豚鼠平均听阈之间的差异不显著,A组豚鼠经ABR检测平均听阈为(7.62±5.27)dB peSPL,B组为(7.50±3.78)dB peSPL;用药后,A组为(17.14±4.69)dBpeSPL,B组为(14.67±4.4.2)dB peSPL。A组ABR听阈平均提高(10.00±6.78)dBpeSPL,B组为(7.67±5.30)dB peSPL。经t检验,A组和B组之间听阈提高值差异无显著性意义(P＞0.05)。经噪音干预后,A组平均听阈再次提高(22.97±10.56)dB peSPL,B组(14.16±7.36)dB peSPL,两组之间听阈提高值差异显著。C组三次听阈之间差异无显著性意义。 2.组织生化结果A组豚鼠肝、脑SOD活力分别为(70.72±17.47)U,(53.43±19.24)U,B组分别为(95.66±8.49)U,(80.28±22.37)U,A组活力明显低于B组,其差异达到极显著水平。A组豚鼠肝、脑MDA水平分别为(14.24±4.86)U,(18.33±5.68)U;B组分别为(10.39±2.89)U,(13.43±4.05)U,A组明显高于B组,二者差异极显著。 3.组织学观察组织学观察模型对照组肝小叶结构完整,肝细胞排列整齐,肝细胞呈多边形,胞浆丰富,核仁清晰,汇管区见小叶间动、静脉。模型老化组肝细胞索排列紊乱,部分肝细胞变性,胞浆明显疏松、肿胀,并可见点状坏死。模型对照组脑皮层神经元体积大,细胞核大,细胞核中常染色质丰富,异染色质少,核膜和核仁清晰。模型老化组表现出较多衰老变化,部分神经元有变形、萎缩,失去正常神经元形态。细胞核内异染色质增多,常染色质减少,少量神经元细胞核消失。 4.AFLP技术分析提取的内耳DNA经酶切、连接及预扩增。预扩增产物经20对引物扩增后,PAGE胶电泳后均可见清晰条带,其中,老化组与对照组及空白组经14条引物扩增无差异,6条引物扩增结果有多态性条带,表现为条带的增加或缺失。经统计分析,有1条引物(T2/P3)扩增的差异条带与我们的听阈结果一致,表现为老化组多一条带。经重复试验,结果完全一致,表明AFLP重复性好,结果可靠。 5.差异片段克隆测序及相关分析结果差异片段克隆测序后经分析发现与鼠有同源性,证实其真实性；而蛋白质搜索结果显示：差异序列与周质传感信号转导组氨酸激酶(periplasmic sensor signal transduction histidine kinase)等功能蛋白同源,提示差异片段可能来自编码基因。 结论： 1.生化指标及组织学变化表明D-半乳糖诱导的老化豚鼠模型构建成功； 2.此模型豚鼠对噪音损伤的敏感性增加； 3.AFLP检测到的差异片段所涉及的基因可能是其对噪音敏感的因素； 4.本研究认为AFLP技术是一种较稳定可靠的差异基因筛选方法,可运用于分子生物学研究。