目的原发性肝癌是病死率很高的恶性疾病，除早期发现早期手术治疗外，肝癌对放射治疗不敏感。寻找有效预防和治疗肝癌的药物是当前的研究热点之一。ED-71属甾体激素，有效成分为1，25-（OH）₂D₃类似物，对钙磷离子的调节作用减弱，可以作为高效的细胞分化诱导剂，能有效的诱导恶性肿瘤细胞分化、抑制细胞增殖、调节抑癌基因的表达，同时对免疫功能有调节作用等，近年来关于ED-71的抗肿瘤活性的研究日益受到重视。近期研究显示维生素D₃类似物ED-71对白血病和一些实体瘤有诱导分化作用，表现出较大的抗肿瘤潜力，但该药对肝癌的作用尚未见报道。本实验分三个部分观察ED-71对肝癌的抑制和预防作用。1、研究维生素D₃类似物ED-71对人肝癌细胞株HepG₂的生长抑制作用，对凋亡的作用和对细胞周期的影响。2、探讨维生素D₃类似物ED-71抑制人肝癌细胞株HepG2增殖和诱导细胞凋亡的作用机制。从mRNA和蛋白两个水平观察ED-71是否通过诱导抑癌基因P21WAF1／CIP1、P27kip1的功能实现对人肝癌细胞株HepG2增殖的抑制，是否通过促进胰岛素样生长因子受体结合蛋白-3（IGFBP-3）的表达而促进了细胞的凋亡3、建立大鼠肝癌试验动物模型，观察维生素D₃类似物ED-71对模型动物肝癌发生的作用，探讨ED-71在动物体内预防和治疗肝癌作用及可能机制。方法1、以RPMI 1640为基本培养基进行人肝癌细胞株HepG₂的培养、传代、冻存、复苏等工作。利用四唑盐比色法（MTT）检测对人肝癌细胞株HepG₂增值活性的影响，相差倒置显微镜观察ED-71干预后人肝癌细胞株HepG₂的生长状态和形态学改变，落射荧光显微镜观察细胞凋亡形态，透射电子显微镜观察人肝癌细胞株HepG₂凋亡的超微结构改变、细胞集落形成法观察细胞的生长能力的变化，流式细胞仪（FCM）检测细胞的周期改变和凋亡。2、半定量RT-PCR法检测抑癌基因P^{21WAF1／CIP1}、P^27kip1和凋亡相关基因IGFBP-3的mRNA在HepG₂细胞中用药前后的表达水平。Western-blot法观察P^{21WAF1／CIP1}、P^27kip1、IGFBP-3蛋白在HepG₂细胞中处理前后的表达情况。3、以二乙基亚硝胺（Dieth Lintrosamine，DEN）建立大鼠的肝癌实验动物模型。解剖实验动物，观察ED-71对实验大鼠肝癌结节数量的影响；用免疫组织化学方法，检查ED-71对大鼠肝肿瘤组织中肝脏胎盘型谷胱甘肽S转移酶（glutathione S-transferase placental type，GST-P）和增殖细胞核抗原(PCNA（Proliferation Cell Nuclear Antigen，PCNA）细胞阳性率的影响；用流式细胞术分析ED-71对大鼠肝组织细胞增殖周期的影响、检测ED-71对大鼠肝组织细胞凋亡的作用。结果1、细胞形态观察显示ED-71明显改变了人肝癌细胞株HepG₂的形态和生物学行为。HepG₂细胞经ED-71(药物浓度分别为10^-7 mol·L^-1，10^-6 mol·L^-1)作用24h后，细胞形态由多角形转变为成纤维细胞样，细胞胞质向外周伸出树枝样突起，细胞间连接减少，细胞核浆比例减小，细胞核核仁消失，肾形核多见，细胞分裂相减少，贴壁细胞明显减少。随ED-71作用浓度增加和作用时间延长，上述改变更为明显，有凋亡小体形成，部分细胞出现细胞膜裂解，细胞结构模糊，胞浆胞核分界不清，细胞核核膜不完整，细胞胞体破裂呈碎片样，失去正常的细胞形态和结构。瑞式染色细胞核较对照组变淡，细胞分裂相减少2、四唑盐比色法（MTT）检测对人肝癌细胞株HepG₂增值活性的影响，结果显示ED-71抑制人肝癌细胞株HepG₂的生长。ED-71 10^-8mol·L^-1，10^-7mol·L^-1，10^-6mol·L^-1，10^-5mol·L^-1作用48小时对HepG₂细胞的抑制率分别为：25.84％，36.28％，52.03％，52.10％；10^-8mol·L^-1，10^-7mol·L^-1，10^-6mol·L^-1，10^-5mol·L^-1作用72小时对HepG₂细胞的抑制率分别为：28.32％，58.22％，72.31％，78.46％。实验组和对照组比较P＜0.01。3、流式细胞仪（FCM）检测细胞周期显示：ED-71可显著影响人肝癌细胞株的细胞周期分布，ED-71 10^-8mol·L^-1，10^-7 mol·L^-1，10^-6 mol·L^-1，10^-5 mol·L^-1作用于HepG₂细胞48h，观察到G₀／G₁细胞明显增加（P＜0.01），S期细胞明显减少（P＜0.01），G₂／M期细胞变化不明显（P＞0.05）。ED-71可以引起人肝癌细胞株发生细胞周期阻滞，即细胞周期阻滞在G₀／G₁期。4、FCM检测细胞凋亡（FITC／PI法）显示：ED-71(10^-8mol·L^-1，10^-7mol·L^-1，10^-6 mol·L^-1，10^-5 mol·L^-1)作用HepG₂ 48h细胞凋亡率分别达（27.3±2.3）％，（33±6）％，（35±5）％，（48±7）％，明显高于对照组（8±4）％（P＜0.05）。差异有显著性。荧光显微镜下观察对照组HepG₂细胞核染色均匀，绝大多数细胞核可见淡蓝色荧光，ED-71 10^-6mol·L^-1作用48h后HepG₂细胞出现细胞核变小，染色质聚集呈不均匀块状并发出粉红色荧光。透射电镜下观察细胞超微结构，发现用药后(ED-71 10^-6 mol·L^-1，作用细胞72h)细胞核明显缩小，核浆比减小，核仁减少、浓缩甚至消失，核内异染色质明显增多，并沿核膜边缘聚集增多，核膜完整。细胞浆内充满大小不等空泡，胞浆有部分溶解，出现了自噬体，细胞表面微绒毛变粗变短，数量减少甚至消失，细胞膜及核膜均基本完整，表现出典型的凋亡特征。5、人肝癌细胞株HepG₂中P^{21WAF1／CIP1}、P^27kip1表达水平非常低。1×10^-8、1×10^-7、1×10^-6、10^-5mol／L浓度的ED-71作用于HepG₂细胞24h，RT-PCR检测药物作用组细胞P^{21WAF1／CIP1}、P^27KIP1蛋白表达较对照组细胞显著增加（p＜0.05）。1×10^-8、1×10^-7、1×10^-6、10^-5mol／L浓度的ED-71 HepG₂细胞48h，Western-biot检测结果显示P^{21WAF1／CIP1}、P^27kip1蛋白的表达明显增加（p＜0.05）。ED-71作用HepG₂细胞24h后，可以检测到细胞中IGFBP-3mRNA表达水平显著增加，ED-71作用HepG₂细胞48h后，Western-biot检测结果显示细胞中IGFBP-3蛋白表达水平显著增加（均p＜0.05）。6、动物实验结果显示：以DEN按从小剂量开始，逐渐增加剂量的给药方式建立大鼠肝癌模型，实验结束（20周）时模型组的大鼠均发生肝癌，并且未有大鼠意外死亡。ED-71可以明显减少大鼠肝癌结节的数量（P＜0.05）。ED-71显著降低大鼠肝组织GST-P及PCNA细胞的阳性率、提高细胞凋亡率。流式细胞仪检测肝细胞的增殖周期，结果显示，在第12和20周时，ED-71组动物肝脏细胞G₀／G₁期细胞较对照组明显增多（P＜0.05），而S期和G₂／M期细胞则减少。说明在DEN诱导的大鼠肝癌模型中，ED-71可以阻滞肝细胞的增殖于G₀／G₁期。在诱癌过程中，各模型组动物AFP的水平随时间的延长而逐渐升高，而ED-71组动物AFP水平较对照组明显降低。ED-71显著降低了诱癌过程中大鼠体重降低和肝重增加的程度。ED-71对实验大鼠的血液中钙磷的代谢无显著影响。结论1、恶性肿瘤的诱导分化作为治疗肿瘤的新策略和新的方向，近年来备受关注。寻求应用高效低毒的诱导分化剂是这一策略的核心和目标。肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药的敏感性、肿瘤细胞和癌分子生物学特性的重要手段。人肝癌细胞株HepG₂，保存了较完整的生物转化代谢酶及其活性，其细胞学遗传特点和人类无种属差异性，可作为体外遗传毒理学实验的有效工具。本研究显示维生素D₃类似物ED-71明显抑制人肝癌细胞株HepG₂的生长，使细胞形态发生显著的改变，细胞的集落形成能力减弱，并且随ED-71作用浓度增加和作用时间延长，上述改变更为明显。ED-71使人肝癌细胞发生细胞周期阻滞，G₁期的细胞增加，G₂和S期的细胞减少。细胞的凋亡率增加，ED-71诱导了细胞的凋亡。以上结果提示维生素D₃类似物ED-71对人肝癌细胞株HepG₂的确有诱导分化作用，具体表现为能明显改变细胞的形态，抑制细胞的生长能力，显著降低细胞的增殖分裂能力，使细胞发生周期阻滞，即细胞停滞在G₀／G₁期，同时增加细胞的早期凋亡率。2、调控生长的基因（如原癌基因等）和调控抑制生长的基因（如抑癌基因等）的协调表达是调节控制细胞生长的重要分子机制之一。这两类基因相互制约，维持正负调节信号的相对稳定。细胞周期是细胞增殖分化的最后共同通路。P^{21WAF1／CIP1}是属于细胞周期负调节蛋白家族中的重要成员，有资料证实在转化细胞中P^{21WAF1／CIP1}的表达对增长停滞和细胞周期阻滞起到关键的作用。P^27kip1作为细胞周期的负调控因子，具有阻止细胞通过G1／S期转换的“关卡”作用，从而抑制细胞的增殖，使细胞有机会修复损伤的DNA或DNA复制中产生的错误。临床研究证实P^27kip1表达降低或缺失与肝内转移、肿瘤复发及生存期缩短显著相关，P^27kip1可作为HCC的一个独立的预后指标。胰岛素样生长因子促进细胞增殖并抑制凋亡，在肿瘤发生中的作用越来越受关注。IGF作用受其结合蛋白IGFBP调节，其中IGFBP3是主要的调节蛋白，它通过竞争抑制IGF与其受体结合，从而阻断IGF的效应，表现为抑制生长和促进凋亡。我们的结果显示，维生素D₃类似物ED-71能诱导HepG₂细胞中抑癌基因P^{21WAF1／CIP1}、P^27kip1基因的重新表达，同时提高胰岛素样生长因子受体结合蛋白-3（IGFBP-3）基因的表达。ED-71处理后P^{21WAF1／CIP1}、P^27kip1、IGFBP-3蛋白质的合成增加。提示可能通过以上途径发挥对HepG₂细胞的生长抑制和促进凋亡作用。3、DEN在大白鼠所诱发的肿瘤多为肝细胞癌，和人肝细胞癌比较相似。从治疗和预防的角度来看，抑制癌前细胞的增生或促进癌细胞的分化都有重要意义。GST-P在大鼠肝癌病灶中高度表达，而在正常大鼠肝细胞基本不表达，因此GST-P被认为是大鼠肝癌形成的最好的实验性肿瘤标记。AFP是肝癌较特异的标志物，对肝癌的诊断及术后复发的提示有重要意义。本研究结果显示，本研究结果显示，ED-71可以显著减少癌结节及GST-P阳性细胞的数量、降低AFP的水平，该结果说明：ED-71可以减少DEN诱导的大鼠肝癌模型的肝癌的发生，对DEN诱导大鼠肝癌有预防作用，并诱导其凋亡。4．本次研究结果为临床应用ED-71预防高危人群肝癌的发生及治疗后复发提供了令人鼓舞的理论及细胞学和动物实验依据。