论文部分内容阅读
BK通道是一种钾离子通道,因具有最大的单通道电导(约300pS)而得名,可以同时响应跨膜电压及胞内钙离子浓度两种信号。BK通道由α功能亚基(S1o1)和β辅助亚基组成。α亚基形成了通道的主要功能结构,它含有7次跨膜域S0-S6以及一个较大的C端RCK结构,其上含有的D362,D367和Ca2+bowl两个钙离子结合位点。p亚基有四个(β1、β2、β3、β4),它们均由两段跨膜区TM1-2支撑着一个较大的胞外loop区,N端和C端都位于胞内。BK通道的α功能亚基在人体大部分组织中都具有表达,再加上β辅助亚基在不同组织中的特异表达便形成了BK通道在不同组织中的不同功能,如参与神经递质的释放、血管平滑肌收缩、神经冲动的超极化等。BK通道的动态钙敏感性以及α功能亚基和β辅助亚基间相互作用机制的研究一直在进行,但由于技术或方法的限制,使其多年来一直是BK通道领域内难以彻查的迷题。而深入研究BK通道这些特性对其参与的众多生理活动的调节的理解以及BK通道相关的疾病机理研究乃至治疗都意义深远。本文的研究工作主要包括对BK通道相关的两个问题的研究：第一部分,我们结合传统的膜片钳技术与光解钙释放技术研究了BK通道对快速变化的钙信号的响应以及通道的钙结合时间物理常数。我们知道在对BK通道的研究中通常会先恒定胞内／通道内侧的钙浓度,更多的在电压上面做文章来研究通道的相关特性,但实际生理活动中的钙信号通常都是实时变化的,BK通道本身对动态钙信号的响应就是一个值得深究的问题。同时,科学研究中对生理活动中钙信号的监测主要依赖荧光的方法来得到整个胞内global的钙信号的“平均”,而精确触发、调节某些生理活动事实上更依赖于膜上的local钙浓度,这个重要的生理参数多年来一直没有很好的方法来测量。在这一部分的研究中,我们的主要研究结果和结论如下：(1)我们利用光解钙释放过程中亚毫秒级的钙信号变化研究了BK通道对快速变化的钙信号的响应,确定了BK通道的钙结合时间常数为1.8*108M-1s-1。结果同时表明BK通道对钙信号的变化有着超快的响应,可以无延时的跟随亚毫秒级的钙信号变化。(2)随后我们根据BK通道可无延时的跟随钙信号变化的特性,将BK通道作为钙探测器测量了仿动作电位中的local钙浓度的变化：在动作电位的上升期及下降前期,该local钙浓度持续上升至≥20μM,然后伴随动作电位的下降相而下降并大约稳定在4μM。(3)我们检测了一个跟癫痫相关的BK通道突变体D369G对来自Cav1.2钙通道的变化钙信号的响应,证明该突变体通道不仅在稳态钙浓度下比野生型BK通道具有更高的钙敏感性,而且对变化的钙信号也具有更快的响应,为更好的理解BK通道引起的癫痫提供了新的思路。第二部分我们综合运用了双循环法、整流检验法、免疫荧光驻留法以及结构生物学,主要研究了带β2辅助亚基的(mSlo1/β2型)BK通道功能亚基α与辅助亚基β2间的相互作用。我们知道由β亚基在不同组织中的特异表达也会产生BK通道在不同组织中的不同功能,而BK通道亚基间的相互作用机制的阐明是理解BK通道在这些功能中的理论基础,但是目前仍然没有BK通道复合体Slo1/βx的结构,加上精确研究通道蛋白间相互作用的方法的限制,该问题多年来一直没有得到很好的解答。在此部分的研究中,我们的主要研究结果和结论如下：(1)我们确定了BK(β2)通道的预失活作用点PI site (Pre-inactivation site)以及通道的失活机制模型：C←→O←→O*←→I,即通道在失活前,β2的N端失活臂上的β2(E16,D17)位两个负电氨基酸残基会先瞬时的结合在通道口部的mSlo1(K330,K331)两个正电氨基酸,形成预失活点PI site及瞬时开放态O*后才会失活。(2)我们确定了BK(β2)通道的增强性激活作用点E site (Enhanced activation site),它由β2的N端根部的β2(D44,E45)位两个负电氨基酸残基与位于其下方的mSlo1(K392,R393)两个正电氨基酸相结合而形成,对α与β的结合及上膜有重要影响。(3)我们进一步确定BK(β2)通道的增强性激活作用来源于ECaB site(ECa2+bowl site),它是由BK通道的其中一个钙结合位点Ca2+bowl与β2的N端中部的β2(K33,R34,K35)位三个正电氨基酸残基相互作用而形成。由此我们解开BK(β2)通道的增强性激活作用的通路：它由ECaB site产生,经E site的定滑轮作用而优化了钙离子门控的力使得S6开门更加容易。(4)我们同时也建立了一种研究BK通道亚基间相互作用的可行又可靠的方法,运用此方法以及p亚基间氨基酸序列的保守性,我们解开了BK通道a与β1亚基间相互作用的迷题,也为其它通道间的相互作用问题的研究提供了重要的参考。综上所述,本文致力于对BK通道动态钙敏感性以及亚基间相互作用机制的研究,成功解决了几个领域内众人关心的问题,对BK及其它通道的基础研究以及相关的病理研究提供了较为扎实的基础。