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背景:白癜风是一种因表皮黑素细胞破坏消失导致皮肤黏膜出现白斑的自身免疫性疾病。国内外研究表明,CD8+T细胞介导的免疫应答是导致黑素细胞损伤的关键效应环节,但启动白癜风异常免疫应答的因素和机制尚未完全阐明。机体代谢稳态是组织器官免疫反应的基础调节剂。部分代谢物具有不依赖于传统上作为生物合成和能量代谢过程中的底物和中间体的免疫调节作用,称为免疫代谢物,其可通过调节炎性因子分泌、转录因子活性等激活或抑制免疫功能。我们前期对白癜风合并代谢性疾病的相关研究进行Meta分析发现,白癜风与糖尿病存在相关性,另有研究表明降脂药物可促进白癜风白斑复色,提示糖脂代谢紊乱参与白癜风疾病进程。但到目前为止,尚无针对糖脂代谢紊乱在白癜风发病中的作用和机制的系统性研究。本课题首先应用病例对照研究明确糖脂代谢紊乱在白癜风发病中的作用,进一步结合靶向代谢组学和体外细胞实验探讨糖脂代谢紊乱调控白癜风发病的机制,研究结果将为白癜风的防治策略提供新方向和理论依据。目的:1.明确糖脂代谢紊乱与白癜风发病的相关性。2.筛选介导糖脂代谢紊乱调控白癜风发病的关键免疫代谢物。3.探讨关键免疫代谢物调控白癜风异常免疫应答的机制。方法:1.糖脂代谢紊乱与白癜风发病相关性的病例对照研究。按纳入排除标准收集白癜风患者(病例组)和自然人群(对照组),病例组和对照组研究对象按性别、年龄进行1:2匹配。研究对象自愿签署知情同意书后填写调查问卷,收集研究对象基本信息、疾病流行病学信息、体格检查等资料,同时收集研究对象外周血液样本,检测糖脂代谢指标水平,包括葡萄糖、糖化血红蛋白、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白水平,糖脂代谢紊乱依据医学参考值范围判定为高血糖、高糖化血红蛋白、高胆固醇、高甘油三酯、低高密度脂蛋白、高低密度脂蛋白。综合应用单因素分析(2×2卡方检验、R×C卡方检验、Mantel-Haenszel卡方检验)和多因素分析(二项logistic回归、无序多分类logistic回归、有序多分类logistic回归),探讨糖脂代谢紊乱与白癜风患病和临床特征(活动性、严重程度、分型)的相关性。2.免疫代谢物琥珀酸介导高血糖调控白癜风发病的靶向代谢组学研究。(1)从病例对照研究收集的研究对象中选择30例有代表性的处于进展期的中度或中-重度白癜风患者(病例组)和30例年龄、性别匹配的自然人群(对照组),应用液相色谱-质谱联用技术靶向定量检测血清中12种能量代谢物的水平,包括葡萄糖和11种免疫代谢物(丙酮酸、乳酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、草酰乙酸、衣康酸、乙酰辅酶A、琥珀酰辅酶A)。综合应用单维统计分析(Mann-Whiney U检验、火山图)、多维统计分析(主成分分析、正交偏最小二乘判别分析、VIP plot)和Spearman秩相关性分析筛选白癜风患者和自然人群血清差异免疫代谢物。(2)应用琥珀酸检测试剂盒检测病例对照研究收集的所有研究对象血清琥珀酸水平,应用Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis H检验分析血清琥珀酸与白癜风患病和临床特征(活动性、严重程度、分型)的相关性。(3)应用琥珀酸检测试剂盒检测白癜风患者白斑皮损部位和正常非皮损部位疱液琥珀酸水平,应用配对t检验分析皮肤组织微环境琥珀酸水平与白癜风白斑形成的相关性。3.琥珀酸与SUCNR1结合启动白癜风异常免疫应答的体外细胞研究。(1)应用免疫荧光检测皮肤组织中CD8+T细胞琥珀酸特异性受体SUCNR1表达情况;使用不同浓度琥珀酸刺激外周血单个核细胞,应用流式细胞术检测CD8+T细胞增殖(CFSE)、活化(CD69)、杀伤功能(IFN-γ、Granzyme B、Perforin)标志分子表达水平。(2)应用免疫荧光检测皮肤组织中黑素细胞SUCNR1表达情况;使用不同浓度琥珀酸刺激黑素细胞系PIG1细胞,应用Western blot检测PIG1细胞SUCNR1表达水平;使用不同浓度琥珀酸刺激PIG1细胞,应用ELISA检测培养上清中CRT、IL-6、IL-8、HMGB1、CXCL12分泌水平;使用SUCNR1 si RNA或SUCNR1拮抗剂预处理PIG1细胞后给予琥珀酸刺激,应用ELISA检测培养上清中CRT分泌水平。(3)应用免疫荧光检测皮肤组织中角质形成细胞SUCNR1表达情况;使用不同浓度琥珀酸刺激角质形成细胞系Ha Ca T细胞,应用Western blot检测Ha Ca T细胞SUCNR1表达水平;使用不同浓度琥珀酸刺激Ha Ca T细胞,应用ELISA检测培养上清中IL-1β、IL-15、CXCL9、CXCL10、CXCL16分泌水平;使用SUCNR1 si RNA或SUCNR1拮抗剂预处理PIG1细胞后给予琥珀酸刺激,应用ELISA检测培养上清中IL-1β、CXCL9、CXCL10分泌水平。结果:1.糖脂代谢紊乱与白癜风发病相关性的病例对照研究。(1)按照纳入排除标准共收集321例白癜风患者(病例组)和642例自然人群(对照组)。综合2×2卡方检验和二项logistic回归分析结果显示,高血糖与白癜风存在相关性,是白癜风的危险因素,高血糖者发生白癜风的风险是血糖正常者的1.781倍(OR=1.781,95%CI=1.131~2.806,P=0.013),其余代谢指标异常与白癜风患病无显著相关性(P>0.05)。(2)根据白癜风活动性判定标准,321例白癜风患者中包含108例稳定期白癜风患者和213例进展期白癜风患者。综合2×2卡方检验和二项logistic回归分析结果显示,高血糖、高胆固醇与白癜风活动性存在相关性,是白癜风活动性的危险因素,高血糖者白癜风活动性进展的风险是血糖正常者的2.576倍(OR=2.576,95%CI=1.027~6.460,P=0.044),高胆固醇者白癜风活动性进展的风险是胆固醇正常者的3.217倍(OR=3.217,95%CI=1.080~9.580,P=0.036),其余代谢指标异常与白癜风活动性无显著相关性(P>0.05)。(3)根据白癜风严重程度判定标准,321例白癜风患者中包含119例轻度白癜风患者、157例中度白癜风患者、45例中-重度白癜风患者。综合Mantel-Haenszel卡方检验和有序多分类logistic回归分析结果显示,高血糖与白癜风严重程度存在相关性,是白癜风严重程度的危险因素,高血糖者白癜风严重程度增加一级的风险是血糖正常者的2.707倍(OR=2.707,95%CI=1.073~6.828,P=0.035),其余代谢指标异常与白癜风活动性无显著相关性(P>0.05)。(4)根据白癜风分型判定标准,321例白癜风患者中包含36例节段型白癜风患者、258例非节段型白癜风患者、19例混合型白癜风患者和8例未定类型白癜风患者。综合R×C卡方检验和无序多分类logistic回归分析结果显示,各糖脂代谢指标异常与白癜风分型均无显著相关性(P>0.05)。2.免疫代谢物琥珀酸介导高血糖调控白癜风发病的靶向代谢组学研究。(1)靶向代谢组学结果显示,白癜风患者血清葡萄糖水平高于自然人群(P<0.05),免疫代谢物衣康酸、琥珀酸、富马酸水平高于自然人群(P<0.05),且衣康酸、琥珀酸、富马酸水平与葡萄糖水平呈正相关性(P<0.05)。文献表明,琥珀酸具有免疫激活作用,衣康酸、富马酸具有免疫抑制作用,且二者在免疫激活条件下多呈升高趋势以平衡免疫反应,因此,选定琥珀酸作为介导高血糖调控白癜风发病的潜在关键免疫代谢物并作进一步验证。(2)扩大样本量检测642例自然人群和321例白癜风患者血清琥珀酸水平,结果显示,白癜风患者血清琥珀酸水平高于自然人群(P<0.05),进展期白癜风患者血清琥珀酸水平高于稳定期患者(P<0.05),白癜风患者血清琥珀酸水平随疾病严重程度增加呈升高趋势(P<0.05),不同类型白癜风患者血清琥珀酸水平无显著差异(P>0.05),表明琥珀酸与白癜风患病、活动性和严重程度存在相关性,是介导高血糖调控白癜风发病的关键免疫代谢物。(3)收集并检测了30例白癜风患者白斑皮损部位和正常非皮损部位疱液琥珀酸水平,结果显示,白斑皮损部位疱液琥珀酸水平高于正常非皮损部位(P<0.05),表明皮肤组织微环境中琥珀酸水平与白癜风白斑形成相关,进一步证实琥珀酸是介导高血糖调控白癜风发病的关键免疫代谢物。3.琥珀酸与SUCNR1结合启动白癜风异常免疫应答的体外细胞研究。(1)皮肤组织中CD8+T细胞表达SUCNR1;与对照组相比,琥珀酸组CD8+T细胞CFSE阳性细胞比例、CD69、IFN-γ、Granzyme B、Perforin表达水平均无显著差异(P>0.05),表明琥珀酸对CD8+T细胞功能无显著影响。(2)黑素细胞表达SUCNR1;琥珀酸刺激下,PIG1细胞SUCNR1表达水平上调;琥珀酸刺激下,PIG1细胞CRT分泌水平升高(P<0.05),IL-6、IL-8、HMGB1、CXCL12分泌水平无显著变化(P>0.05);干涉或拮抗PIG1细胞SUCNR1可抑制琥珀酸诱导的CRT分泌(P<0.05),表明琥珀酸与黑素细胞SUCNR1结合促进炎性因子CRT分泌。(3)角质形成细胞表达SUCNR1;琥珀酸刺激下,Ha Ca T细胞SUCNR1表达水平上调;琥珀酸刺激下,Ha Ca T细胞IL-1β、CXCL9、CXCL10分泌水平升高(P<0.05),IL-15、CXCL16分泌水平无显著变化(P>0.05);干涉或拮抗Ha Ca T细胞SUCNR1可抑制琥珀酸诱导的IL-1β、CXCL9、CXCL10分泌(P<0.05),表明琥珀酸与角质形成细胞SUCNR1结合促进炎性因子IL-1β、CXCL9、CXCL10分泌。结论:本研究首次探讨了糖脂代谢紊乱在白癜风发病中的作用和机制。本研究发现,高血糖与白癜风患病、活动性和严重程度存在相关性,是白癜风患病、活动性和严重程度的危险因素,脂代谢紊乱与白癜风发病无显著相关性;琥珀酸是介导高血糖调控白癜风发病的关键免疫代谢物;琥珀酸与黑素细胞和角质形成细胞表面的琥珀酸受体SUCNR1结合,促进炎性因子CRT、IL-1β、CXCL9和CXCL10分泌,启动CD8+T细胞介导的免疫应答,导致黑素细胞损伤。本研究为白癜风的各级预防策略提供了新方向和理论依据,为白癜风病因学研究提供了新线索,为白癜风治疗策略提供了新靶点。