HMGB1对脑卒中诱导的脑组织炎症反应和外周免疫抑制的效应及机制研究

被引量 : 0次 | 上传用户:gudujian13
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
研究背景:缺血性脑卒中是发病率和致残率最高的疾病之一。缺血区血管可因再通而发生脑缺血再灌注损伤(CIRI)。CIRI诱导脑组织炎症反应和外周免疫系统抑制(SIID,以淋巴细胞数量减少,功能抑制为主要特征,其诱导感染发生率增高)双向效应,目前治疗手段有限。CIRI后,坏死神经元释放高迁移率蛋白B1(HMGB1),其是一种细胞因子样蛋白,在CIRI病理过程中发挥重要作用。前人研究表明CIRI后,小胶质细胞/巨噬细胞、中性粒细胞及T细胞等免疫细胞浸润于缺血区,参与脑组织炎症反应。已经证实,HMGB1的致炎效应,可通过作用于小胶质细胞/巨噬细胞而发挥和传递。HMGB1是否同时作用于浸润的T细胞,甚至因T细胞与巨噬细胞有交互作用而通过T细胞再间接作用于巨噬细胞,目前还不清楚。不仅如此,CIRI后,HMGB1尚可通过破损的血脑屏障进入脑脊液甚至外周血。前人研究报导,大剂量HMGB1可通过作用于树突状细胞(DCs)或者直接作用于T细胞,诱导T细胞免疫功能抑制,而脑卒中后大量入血的HMGB1,是否与外周淋巴细胞数量和功能改变有关,是否介导SIID的发生,目前尚无研究报导。研究目的:拟采用局灶性脑缺血再灌注损伤模型,应用HMGB1抑制剂Glycyrrhizin(甘草甜素),观察CIRI后,HMGB1在缺血脑组织中的定位和表达情况,脑组织炎症反应情况,以及外周器官中T细胞数量改变,同时采用T细胞缺陷动物,离体和在体观察T细胞缺陷,对HMGB1效应的影响及二者的相关性,旨在探讨HMGB1在CIRI诱导的脑组织炎症反应和外周免疫抑制中的效应及机制,为脑卒中的治疗和预后提供新靶标。研究方法:本研究首先采用野生型Sprague Dawley (SD)大鼠及CD57BL/6J小鼠,建立大脑中动脉短暂性阻塞的局灶性脑缺血再灌注损伤模型(MCAO),于再灌注后12、48及72小时,免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜观察HMGB1在缺血脑组织、局部神经元和小胶质细胞/巨噬细胞中的定位、表达情况。而后,于动物腹腔在MCAO再灌注后即刻及3.5小时各注射一次Glycyrrhizin,TTC染色法观察大鼠脑梗塞体积,免疫荧光染色法检测缺血区小胶质细胞/巨噬细胞和中性粒细胞浸润情况,以及流式细胞仪检测缺血大脑半球单核/巨噬细胞、淋巴细胞及其亚型CD4+、CD8+T细胞等免疫细胞的数量,以探讨HMGB1对CIRI脑组织炎症和脑损伤的效应及机制。然后,采用野生型SD大鼠及T细胞缺陷的裸大鼠,在短暂性局灶性脑缺血再灌注损伤(MCAO)及永久性电凝大脑中动脉远端的永久性局灶性脑缺血再灌注损伤(dMCAO)两种模型中,以及CD57BL/6J野生型小鼠及T、B联合缺陷的SCID小鼠MCAO模型中,以Glycyrrhizin抑制IMGB1, TTC染色法检测再灌注72小时后,动物脑梗塞体积,探讨T细胞缺陷对HMGB1脑损伤效应的影响;接着,将来源于野生型小鼠的脾细胞,过继回输给SCID小鼠,在有无Glycyrrhizin处理之下,观察脑梗塞体积变化,反向验证上述发现;另外,离体将来源于野生型与SCID小鼠的脾细胞,在刀豆蛋白A (ConA)刺激后,与神经元共培养,CCK-8试剂盒检测HMGB1有无被Glycyrrhizin抑制下,神经元的存活率,观察脾细胞对神经元的杀伤效应,进一步验证和支持T细胞缺陷对HMGB1作用的影响。接下来,采用Western-blot和ELISA分别检测MCAO后24小时脑脊液,以及MCAO后5、24、48小时血清中HMGB1水平以及Glycyrrhizin的效应,同时采用流式细胞仪,检测HMGB1有无被Glycyrrhizin抑制下,外周血和脾脏中单个核细胞总数,以及单核细胞/巨噬细胞、淋巴细胞及其亚型CD4+、CD8+T细胞等免疫细胞的数量,以探讨外周血高水平释放的HMGB1,与外周器官淋巴细胞数量减少的相关性。实验结果:1、免疫荧光染色显示HMGB1早在小鼠脑缺血再灌注损伤(CIRI)后12小时即从神经元胞核转移到胞浆,48小时释放至胞外同时伴NeuN+神经元数量减少;与此同时,CIRI后24小时WB检测到脑脊液和ELISA检测到血浆HMGB1高水平表达;2、免疫荧光显示CIRI后72小时脑缺血核心区CD68+小胶质细胞/巨噬细胞及MPO+中性粒细胞浸润增多,而且浸润的小胶质细胞/巨噬细胞亦表达HMGB1;3、应用HMGB1抑制剂Glycyrrhizin,TTC染色显示野生型大鼠脑梗塞体积减小,免疫荧光显示脑损伤核心区小胶质细胞/巨噬细胞和中性粒细胞浸润数量减少,NeuN+神经元数量增多,HMGB1转位和胞外释放减轻;4、流式检测显示缺血再灌注后脑损伤侧包括T细胞,CD4+、CD8+T细胞,NK, NKT及B细胞淋巴细胞数量增多,而Glycyrrhizin抑制淋巴细胞及其亚型浸润于缺血区;5、TTC显示Glycyrrhizin减小MCAO及dMCAO野生型SD大鼠以及MCAO C57小鼠脑梗塞体积,但在T细胞缺陷裸大鼠及T、B联合缺陷SCID小鼠中,其脑保护作用丧失;但SCID小鼠接受WT小鼠脾细胞过继回输,其增大的脑梗塞体积,又可因Glycyrrhizin抑制HMGB1而减小离体在WT或SCID小鼠的脾细胞与神经元的共培养体系中,Glycyrrhizin改善WT而非SCID小鼠脾细胞诱导的神经元死亡;6、Western-blot显示大鼠MCAO24小时,脑脊液HMGB1表达增高;ELISA显示MCAO后5小时,血清HMGB1水平即升高,24小时达到高峰,48小时仍持续高水平表达,Glycyrrhizin显著降低脑脊液及血清HMGB1表达水平;7、流式细胞仪检测结果显示与CIRI后缺血脑组织炎症反应加剧以及外周血释放的HMGB1水平升高相反,MCAO48小时,外周血及脾脏单个核细胞总数,T淋巴细胞,CD4+、CD8+T细胞,以及B淋巴细胞数量减少,而Glycyrrhizin抑制血清高水平HMGB1释放的同时,显著改善淋巴细胞数量的减少。结论:1.HMGB1主要分布于正常神经元细胞核中,CIRI诱导HMGB1向细胞浆转位,并于细胞死亡后释放入脑脊液及外周血;2. HMGB1可能通过双向效应,一方面活化浸润于脑组织的T细胞,介导缺血再灌注损伤后脑组织局部炎症反应,另一方面,通过诱导外周T细胞免疫功能抑制,介导SIID;3. Glycyrrhizin将HMGB1作为靶标,既减轻CIRI脑组织炎症反应,又改善外周免疫抑制,从而治疗脑卒中。
其他文献
第一章总则第一条为了鼓励一切国营、公私合营、合作社经营及私营企业中的工人、工程技术人员和职员以及一切从事有关生产的科学与技术研究工作者的积极性和创造性,使他们充
利用Mannich反应将黑荆树单宁固定在氯甲基化聚苯乙烯树脂表面,成功地制备出一种新型固化单宁大孔吸附树脂(MARIT),并通过正交试验得出适宜的合成条件。苯酚在MARIT上的平衡吸附
基于我国健康老龄化的背景下,对发展老年人运动健康服务产业的必要性以及发展的思路和对策进行研究,以期为运动健康服务产业的发展提供参考。
<正> 苏联在叶甘诺夫石英砂产地新建了一座选砂厂,于1970年投产。该厂设计能力为年产精砂67万吨,其中24万吨砂的Fe2O3含量不超过0.05%,43万吨砂的Fe2O3含量不超过O.08%砂中含铁
会计要素、会计科目、会计账户是应用借贷记账法,进行会计核算的基础,既有理论意义又有实践意义,是初学会计的人必须了解和掌握的内容。由于种种原因,我国对三者的分类有所差
随着无线通信新技术的不断发展,无线业务对频谱资源的需求也快速增长,频谱资源的匮乏成为限制无线通信发展的瓶颈之一。然而,现有的无线通信系统大多采用固定频谱分配的频谱
<正>改革开放以来,我国经济社会发展迅速,城镇化步伐逐年加快。过去30年,我国平均每年有1%的人口迁往城市。城市中的能源、金融、医疗、交通、教育、公共安全、政府等不同系
<正>石鼓,是我国现存最早的文字刻石,因以花岗岩琢成、外形似鼓而得名,其上所刻文字后世称为石鼓文。据金石学家唐兰先生考证,石鼓文的刻凿时代为秦献公十一年(前374),共10枚
会议
慈善组织信息披露制度也称信息公示制度、信息公开披露制度,是指慈善组织为保障捐赠者的利益、接受利益相关者的监督而依照法律规定必须将其自身的财务变化、运作状况等信息
道德榜样教育是以道德榜样的行为、做法、思想、品质、成就影响他人,使之发自内心地效仿、努力地形成与道德榜样相一致的优良品德以期取得预期成果的一种社会实践活动。道德榜