研究背景:结肠癌是最常见的肿瘤之一,应用化学治疗与放射治疗辅助手术切除肿瘤是结肠癌的主要治疗手段。外科手术只能根治性切除早期结肠癌,而中晚期结肠癌又常出现化疗耐药,都对结肠癌的治疗带来挑战。这对结肠癌的治疗造成了很大困难。而结肠作为人体的排泄器官有着独一无二的特殊性,大量的肠道菌群居于结肠,导致结肠内积累大量代谢废物形成高氨环境。因此结肠肿瘤中的氨代谢与其他肿瘤有着显著的差异,很可能导致结肠癌与众不同的耐药性。学界对于氨在肿瘤中的作用,仍未达成共识:一方面认为氨是促进肿瘤生长的一种潜在营养物质,在谷氨酰胺缺乏时作为替代的营养物质,而另一方面认为氨具有毒性会改变细胞的p H影响肿瘤的发展。在结肠癌中氨的作用尚待研究。氨在生理情况下,主要由肝脏通过尿素循环进行代谢。氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ（CPS1）作为氨代谢关键酶之一,在1958年就已经被发现高表达于肝细胞中并起到代谢氨生成尿素的作用。近年来,CPS1已被发现在胃癌、肺癌等肿瘤中表达上调,但在肝癌中表达减少,在乳腺癌中不表达,说明CPS1在不同肿瘤中的地位可能比较复杂。而在多种肿瘤的基因组学数据表明CPS1在结肠癌中增加最为显著,提示CPS1在结肠癌中可能有着较其他肿瘤更为重要的作用。肿瘤微环境已被认为是肿瘤发生发展过程中不可或缺的成分。特别是其中数量最大的肿瘤相关成纤维细胞可以通过分泌多种细胞因子如IL-6、TGF-β和CXCL12等对肿瘤的发生发展起到多种作用。近年来已有研究表明肿瘤成纤维细胞可能对肿瘤细胞的氨代谢也具有一定的影响。前期工作发现氨代谢关键酶CPS1在结肠癌中受肿瘤成纤维细胞的影响表达增加,与肿瘤成纤维细胞共培养也会导致肿瘤细胞的增殖迁移能力提高,但其具体机制尚需进一步研究。研究目的:本实验通过构建人源肿瘤成纤维细胞与结肠肿瘤细胞共培养的模型,以CPS1为切入点,探究肿瘤成纤维细胞通过影响氨代谢改变自噬过程对结肠肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、耐药能力的影响以及CPS1在其中起到的重要作用及相关机制,为寻找结肠肿瘤的治疗手段和靶点提供相应的理论基础。研究方法:1.人源肿瘤成纤维细胞的提取鉴定:用胶原酶消化法提取原代人源肿瘤成纤维细胞和正常成纤维细胞,用Western blot、q RT-PCR、免疫荧光、胶原收缩实验及CCK-8增殖实验对提取到的肿瘤成纤维细胞和正常成纤维细胞进行表征。2.共培养体系的构建以及共培养后肿瘤细胞的CPS1表达:对来自结肠癌患者的肿瘤组织切片进行免疫组化染色检测不同患者的CPS1表达。用Transwell嵌套建立肿瘤成纤维细胞与结肠肿瘤细胞的共培养体系。检测不同结肠肿瘤细胞系共培养前后CPS1及其上游蛋白的表达变化,以及托珠单抗对CPS1的表达变化。3.体内体外实验验证共培养体系和CPS1对肿瘤的促进作用:（1）用慢病毒转染技术构建低表达CPS1的HCT116和RKO稳转细胞系,进行体内实验,建立裸鼠动物模型检测肿瘤成纤维细胞共培养对肿瘤增殖能力的影响以及敲低CPS1对肿瘤增殖能力的影响。对移植瘤进行免疫组化染色检查Ki67和CPS1表达。进行体外实验,用CCK-8实验、免疫荧光实验和Ed U增殖实验检测共培养体系中结肠肿瘤细胞的增殖能力以及敲低CPS1后结肠肿瘤细胞的增殖能力。（2）用Transwell实验检测共培养体系中敲低CPS1前后肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。（3）进行体内实验用裸鼠动物模型检测肿瘤成纤维细胞共培养对结肠肿瘤5-Fu耐药能力的影响。进行体外实验用CCK-8检测肿瘤成纤维细胞共培养对肿瘤细胞5-Fu耐药能力的影响。4.共培养体系通过影响自噬过程促进肿瘤进展的机制研究:应用免疫荧光染色和Western blot实验检测共培养后CPS1的增加部位。用氨浓度试剂盒检测与肿瘤成纤维细胞共培养前后氨的浓度变化。应用Western blot检测不同浓度氨刺激下结肠肿瘤细胞自噬相关蛋白（LC3、P62）的表达变化。应用透射电镜观察肿瘤成纤维细胞共培养前后自噬囊泡的数量。免疫荧光染色检测自噬相关蛋白（LC3、P62）的表达及共定位,检测小鼠肿瘤组织CPS1与P62共染,研究CPS1与自噬的相关关系。Western blot实验检测自噬相关蛋白（LC3、P62、ULK1）水平。应用m Cherry-GFP-LC3双标体系检测与肿瘤成纤维细胞共培养前后自噬水平的变化。研究结果:1.成功提取并纯化肿瘤成纤维细胞和正常成纤维细胞。并验证肿瘤成纤维细胞的胶原收缩能力和增殖能力均高于正常成纤维细胞。2.在结肠癌患者标本进行免疫组化染色发现CPS1在肿瘤成纤维细胞与肿瘤细胞交界处表达明显上调。4种结肠癌细胞系RKO、COLO320、HCT116和CT26在与肿瘤成纤维细胞共培养后CPS1表达均增加且CPS1上游的NF-κB和SIRT5表达均增加,加入托珠单抗后该过程受到抑制。说明肿瘤成纤维细胞可能通过分泌IL-6促进NF-κB和SIRT5进而促进肿瘤细胞CPS1表达。3.CPS1促进结肠肿瘤细胞的增殖。体内和体外实验均表明,共培养体系中的肿瘤成纤维细胞能够促进结肠肿瘤细胞的增殖,且敲低CPS1后这种促进增殖能力明显下降。免疫组化检查明确体内裸鼠移植瘤中Ki67和CPS1高表达,证实肿瘤成纤维细胞通过上调肿瘤细胞中CPS1的表达进而促进结肠癌的增殖。4.用Transwell实验发现于肿瘤成纤维细胞共培养能促进肿瘤细胞迁移侵袭能力,敲低CPS1后迁移侵袭能力下降。5.体内实验和体外实验均表明CPS1的表达能促进5-Fu的耐药能力。6.与肿瘤成纤维细胞共培养后肿瘤细胞中CPS1的细胞核定位增加。CPS1通过降低氨浓度,促进自噬流通畅,从而促进结肠癌进展。透射电镜发现与肿瘤成纤维细胞共培养后肿瘤细胞自噬囊泡减少。应用免疫荧光和m Cherry-GFP-LC3双标体系检测发现肿瘤成纤维细胞能促进肿瘤细胞的自噬通量增加,CPS1能使肿瘤的自噬流通畅。同时证明CPS1是通过降低氨的浓度,抑制了氨对自噬的阻滞作用,使结肠肿瘤细胞的自噬流通畅。结论:1.肿瘤成纤维细胞能促进结肠肿瘤的增殖迁移侵袭以及耐药能力。2.肿瘤成纤维细胞通过分泌IL-6促进结肠肿瘤细胞NF-κB和SIRT5表达进而能促进结肠肿瘤细胞氨代谢关键酶CPS1的表达。3.CPS1能促进结肠肿瘤的增殖迁移侵袭以及5-Fu耐药能力。4.CPS1通过降低氨的浓度促进自噬流通畅促进肿瘤进展。创新点及研究意义:本实验的创新点在于研究肿瘤微环境对结肠肿瘤细胞的影响,采用人源化的成纤维细胞模拟人体内的肿瘤微环境,验证了肿瘤成纤维细胞对结肠肿瘤细胞增殖迁移侵袭能力的促进作用,肿瘤成纤维细胞通过分泌IL-6促进肿瘤细胞氨代谢关键酶CPS1的表达升高。实验探究发现CPS1会通过降低肿瘤微环境中氨的浓度,进而促进自噬流通畅,自噬的通畅导致结肠肿瘤细胞增殖迁移侵袭能力都得到提升。研究表明肿瘤成纤维细胞能促进结肠癌的5-Fu耐药性,这种耐药性的提升也与CPS1的表达增高相关,而通过用托珠单抗拮抗肿瘤成纤维细胞分泌的IL-6,显著的降低了结肠肿瘤细胞CPS1的增加。同时本研究发现不同基因型的肿瘤细胞对肿瘤成纤维细胞的刺激应答不同,后续的研究如果能确定基因型与肿瘤成纤维细胞刺激CPS1表达增加的关系,这可能对联合应用托珠单抗和5-Fu治疗5-Fu耐药患者提供依据,从而实现精准医疗。