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在外科临床严重创伤修复和手术治疗中常需要血管移植物,自体血管取材受限,但是小于5mm直径的人工血管或在血流速度较慢的大口径应用的人工血管早期即易形成血栓。组织工程血管(TEBVs)是研究的方向之一,骨髓间充质干细胞(BMSCs)是重要的种子细胞来源。目前TEBVs研究的瓶颈是种子细胞在体内流体切应力作用下粘附和功能不理想,容易出现细胞凋亡、脱落,使移植失败,但是目前尚没有流体切应力对TEBVs种子细胞BMSCs活性功能影响的研究报道。因此研究流体切应力对TEBVs种子细胞BMSCs生物学功能的影响及其分子机制,对TEBVs构建具有重要的意义。目的1.研究出切应力对骨髓间充质干细胞增殖、凋亡及活性的影响。2.明确在流体切应力对骨髓间充质干细胞功能活性影响的关键蛋白质和相关基因,找到改进骨髓间充质干细胞功能的基因靶点。3.研究出流体切应力对骨髓间充质干细胞功能活性影响的分子机制,为改进骨髓间充质干细胞作为TEBVs种子细胞的功能奠定基础。方法1.采用传统的梯度离心法分离培养骨髓间充质干细胞(hBMSCs),经流式细胞仪进行表面特征CD分子鉴定,并将其诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,并采用骨钙素免疫组化染色和油红O染色进行鉴定。2.对第3代骨髓间充质干细胞分别给予3、10和30 dyne/cm~2的流体切应力2h,6h,24h,通过细胞计数法测定细胞增殖曲线,应用流式细胞仪观察增殖及凋亡,检测Caspase3活性和hBMSCs释放的LDH活性。3.对给予3dyne/cm~2切应力6h的骨髓间充质干细胞的蛋白质采用二维凝胶电泳,以静态培养的骨髓间充质干细胞为对照,将发生差异的蛋白质予以质谱分析,同时用免疫荧光染色和western blotting的方法进一步验证。4.将3dyne/cm~2切应力作用6h后的hBMSCs为实验组,以静态培养的hBMSCs为对照组,通过黏附基因芯片采用Oligo GEARRay基因芯片实验方法和通过凋亡基因芯片采用Oligo GEARRay基因芯片实验方法进行对照研究,并应用rt-PCR验证基因芯片结果,以寻找切应力下hBMSCs变化的关键基因。5.对hBMSCs施加不同流体切应力,观察细胞增殖、凋亡和活性功能同时,针对切应力下hBMSCs凋亡信号传导通路中关键基因应用外源性抑制剂重组基因cIAP1干预和cIAP1拮抗剂DIABLO反向干预,研究切应力下影响hBMSCs活性功能的机制。结果1.所获得的细胞符合骨髓间充质干细胞特征, hBMSCs的表面抗原分子CD29和CD105阳性,CD45、CD34和CD14均为阴性。骨钙素免疫组化染色和油红O染色均呈阳性,可证明能够定向诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。2. 3dyne/cm~2切应力下骨髓间充质干细胞2h和6h时,细胞形态未见明显变化,G2+ S期的细胞百分比显著增高,hBMSCs发生凋亡坏死显著。而3dyne/cm~2切应力和10dyne/cm~2切应力作用24h时,可见平板流动腔内细胞数量减少,30dyne/cm~2切应力作用下,细胞发生显著脱落,作用时间越长细胞脱落越显著,hBMSCs在各组切应力作用6h时即发生显著的凋亡、坏死。各切应力作用2h时和3dyne/cm~2切应力作用6h时hBMSCs中Caspase3活性活性和LDH活性均未发生显著变化;在10dyne/cm~2切应力及30dyne/cm~2切应力作用6h时, hBMSCs的Caspase3活性和LDH活性显著增加。3.蛋白组学研究成功鉴定出切应力作用于hBMSCs后差异蛋白质点32个,其中蛋白质表达显著上调有10种,蛋白质表达显著下调有3种。其中经免疫荧光染色和western blotting显示GAPDH和AnnexinA2表达确实显著上调。4.通过对3dyne/cm~2切应力作用6h后的hBMSCs基因芯片研究结果显示,有6种在切应力作用下显著变化的黏附基因,其中4种基因表达上调超过2倍,分别为ECM-1、ICAM-1、cSPG7、TIMP2;2种基因表达下调超过2倍,分别为LAMA4和VCAM1。同时有5种在切应力作用下显著变化的凋亡基因,其中有2种表达显著上调超过2倍的凋亡基因分别为APAF1和BOK。对基因芯片发现的6种显著变化的粘附基因和5种显著变化的凋亡基因进行了rt-PCR检测,显示基因ECM-1、ICAM-1、cSPG7、TIMP2显著增高(P<0.001和P<0.01),而基因LAMA4和VCAM1显著降低(P<0.001),基因APAF1和BOK显著增高(P<0.001和P<0.01),从而验证了基因芯片的准确性。3dyne/cm~2切应力作用2h后,hBMSCs cIAP1水平升高(P<0.05),但30 dyne/cm~2切应力作用后, hBMSCs cIAP1水平均降低(P<0.05)。5.应用Caspase抑制剂外源性重组cIAP1干预Caspase3的活性和LDH活性均降低,hBMSCs的凋亡减少,细胞增殖增加。加入cIAP1抑制剂DIABLO反向干预后,Caspase3活性和LDH活性增强,细胞凋亡显著增加。结论1.首先研究发现低切应力(3dyne/cm~2)作用较短时间(≤6h)时可促进hBMSCs增殖,hBMSCs未发生显著凋亡,同时内源性cIAP1上调;但在3dyne/cm~2作用12h和10 dyne/cm~2以及30 dyne/cm~2流体切应力下6h时hBMSCs增殖受到抑制,细胞发生显著凋亡坏死,活性功能明显减低。切应力越大细胞凋亡坏死越显著。为hBMSCs种子细胞在体外应用切应力预适应、改善种子细胞的活性功能打下实验基础。2.蛋白质组学研究和基因芯片的筛选,首先发现3dyne/cm~2的切应力作用6h后hBMSCs细胞AnnexinA2和GAPDH表达显著上调,有6种粘附相关基因及5种凋亡相关基因发生显著变化,其中凋亡相关基因APAF1和BOK在切应力作用下显著增强,显示hBMSCs在切应力作用下凋亡与APAF1、BOK和Caspase凋亡基因的启动相关。为进一步改进种子细胞功能提供了基因靶点。3.应用Caspase9抑制剂干预可降低Caspase3的活性和LDH活性,减少hBMSCs的凋亡,细胞增殖增加;加入cIAP1拮抗剂反向干预后Caspase3活性和LDH活性增强,细胞凋亡显著增加。从而首先实验证实hBMSCs在切应力作用下是通过激活了凋亡信号通路机制导致细胞凋亡,出现hBMSCs活性功能下降。4.首先应用外源性重组cIAP1干预可以实现抑制Caspase3的活性和LDH活性,减少hBMSCs在切应力作用下的凋亡,使细胞增殖和活性增加。提示在基因水平对hBMSCs凋亡信号通路靶点(Caspase)进行干预,可作为延迟种子细胞hBMSCs凋亡和改进种子细胞功能的一种手段,为TEBVs的研究提供一个有重要意义的新思路。