第一部分内容：脾脏在小鼠急性心肌缺血再灌注损伤机制中的作用　　研究目的：免疫炎症反应在急性心肌缺血再灌注损伤过程中发挥重要作用。近来研究发现，脾脏参与心肌梗死后损伤修复及心室重塑过程，但其是否参与急性心肌缺血再灌注损伤目前并不清楚。本部分研究内容拟在小鼠在体心肌缺血再灌注损伤模型中探讨脾脏是否在急性心肌缺血再灌注损伤中发挥作用。　　研究内容及方法：利用C57BL6野生型（WT）小鼠分别进行10分钟、20分钟、30分钟、40分钟或50分钟心肌缺血结合60分钟再灌注以构建在体心肌缺血再灌注损伤模型。各缺血时间小鼠分为脾切除组及脾切除假手术组。急性脾切除处理组小鼠在心肌缺血前30分钟切除脾脏。将脾脏分离成脾免疫细胞单细胞悬液，使用台盼蓝染色法判定脾免疫细胞活性。将5×106活脾免疫细胞静脉注入脾切除小鼠以重建脾免疫细胞。分别在20分钟及40分钟心肌缺血组小鼠建立脾切除后脾免疫细胞重建模型。TTC&蓝双染色法检测心肌梗死面积。　　研究结果：TTC染色结果显示：脾切除显著减小40分钟（对照49.6±1.4％ vs脾切除35.7±1.9%，p<0.05）及50分钟（对照：56.4±1.3% vs脾切除：42.6±1.9%, p<0.05）心肌缺血组小鼠再灌注后心肌梗死面积，而对10分钟（对照：0.54±0.36% vs脾切除0.62±0.38%, p=NS）、20分钟（对照：7.25±1.3% vs脾切除：7.0±1.6%，p=NS）及30分钟（对照：34.85±3.2% vs脾切除：29.4±5.2%，p=NS）缺血组再灌注后心肌梗死面积无显著影响。重建脾切除小鼠的脾免疫细胞后可以显著增加40分钟心肌缺血组小鼠再灌注后心肌梗死面积（脾切除：35.7±1.9% vs脾切除+脾细胞重建50.8±0.9%，p<0.05），而对20分钟组心肌缺血组小鼠心肌梗死面积无显著影响（脾切除：7.25±1.3% vs脾细胞重建：7.6±0.9%，p=NS）。　　结论：脾脏在较严重（小鼠模型中缺血时间≥40分钟）心肌缺血再灌注损伤过程中发挥重要作用。　　第二部分内容：HMGB1-RAGE通路构成心脏-脾轴参与心肌缺血再灌注损伤过程，增加再灌注后心肌梗死面积　　研究目的：组织损伤后可以释放“危险信号相关分子”，其中HMGB1被证实在心肌缺血再灌注损伤过程中具有重要作用。其可以通过与RAGE受体结合激活免疫炎症反应促进组织损伤。在第一部分实验结果的基础上我们提出假设：较长时间心肌缺血将导致心肌组织释放更多HMGB1并通过RAGE受体激活脾脏免疫细胞，从而加重心肌再灌注损伤。本部分内容拟在小鼠心肌缺血再灌注损伤模型中进一步证实上述假设。　　研究内容及方法：使用C57BL6小鼠及RAGE基因敲除（Knockout，KO）小鼠建立心肌缺血再灌注损伤模型，所有小鼠再灌注时间均为60分钟。根据第一部分实验结果，我们选取20分钟心肌缺血组小鼠作为低损伤对照进行本部分研究。急性脾切除处理组小鼠在心肌缺血前30分钟切除脾脏。将脾脏分离成脾免疫细胞单细胞悬液，使用台盼蓝染色法判定脾免疫细胞活性。将5×106活脾免疫细胞静脉注入脾切除小鼠以重建脾免疫细胞。部分小鼠于心肌缺血后10分钟或40分钟时取心肌标本获得缺血心肌组织匀浆（Ischemichearthomogenate, IHH）。BCA蛋白浓度测定法用于检测缺血心肌组织匀浆浓度。缺血心肌组织匀浆处理组小鼠于再灌注前5分钟静脉注射10μg/g缺血心肌组织匀浆。TTC&蓝双染色法检测心肌梗死面积。免疫沉淀法用于分离缺血心肌组织匀浆中的HMGB1蛋白。Western-Blot法检测HMGB1表达水平。　　研究结果：与对照组及10-IHH处理组相比，40-IHH显著增加20分钟心肌缺血小鼠再灌注损伤后心肌梗死面积（10-IHH：9.9±1.5% vs40-IHH：33.3±2.5%， p<0.05）。40分钟心肌缺血后心肌组织匀浆中 HMGB1表达水平均显著高于20分钟缺血心肌组织。而使用免疫沉淀技术分离匀浆组织中HMGB1蛋白可以消除40-IHH增加心肌梗死面积作用（40-IHHHMGB1+：30.1±2.37% vs40-IHHHMGB1-：10.1±3.4%，p<0.05）。40-IHH对 RAGEKO小鼠心肌梗死面积无显著影响（对照：7.6±1.0% vs40-IHH：8.4±1.3%，p=NS）。急性脾切除可以阻断40-IHH增加心肌梗死面积作用（40-IHH：33.3±2.5% vs脾切除+40-IHH：9.8±1.7%， p<0.05）。利用野生型小鼠作为供体重建脾切除小鼠的脾免疫细胞后可恢复40-IHH加重心肌梗死作用（脾切除+40-IHH：9.8±1.7% vs脾切除+脾细胞重建+40-IHH：32.6±2.2%，p<0.05），而40-IHH对使用 RAGEKO脾免疫细胞重建的的脾切除小鼠心肌梗死面积无显著影响（脾切除+RAGEKO脾细胞重建：7.4±1.1% vs脾切除+RAGEKO脾细胞重建+40-IHH：7.8±1.5%，p=NS）。　　结论：缺血心肌组织释放HMGB1，后者作用于脾免疫细胞RAGE受体构成心脏-脾轴，参与心肌缺血再灌注损伤。　　第三部分内容：心脏-脾轴通过介导中性粒细胞活化、浸润，增加心肌梗死面积　　研究目的：中性粒细胞是急性心肌缺血再灌注损伤的主要参与者，被认为是免疫损伤的最终执行者。然而近来有研究报道,肝脏再灌注损伤后 HMGB1/RAGE通路可以通过活化中性粒细胞并增强其趋化活性,诱导损伤部位大量中性粒细胞浸润,加重组织损伤。但脾脏在组织损伤后中性粒细胞活化过程中的作用仍不清楚。通过之前的研究内容我们已经证实,缺血心肌组织中 HMGB1通过脾细胞RAGE受体参与心肌缺血再灌注损伤。本部分研究主要探讨心脏(HMGB1)-脾(RAGE受体)轴对心肌缺血再灌注损伤后中性粒细胞浸润的影响,并初步探索可能的治疗策略。　　研究内容及方法：使用C57BL6小鼠建立心肌缺血再灌注损伤模型，进行20分钟与40分钟心肌缺血合并60分钟再灌注。急性脾切除处理组小鼠在心肌缺血前30分钟切除脾脏。部分小鼠于心肌缺血后10分钟或40分钟时取心肌标本获得缺血心肌组织匀浆（Ischemic myocardial homogenate,IHH）。BCA蛋白浓度测定法用于检测缺血心肌组织匀浆浓度。缺血心肌组织匀浆处理组小鼠于再灌注前5分钟静脉注射10μg/g缺血心肌组织匀浆。cFLFLF处理组小鼠于再灌注前5分钟静脉注射FPR1受体特异性阻断剂cFLFLF（500μg/kg）。HemaVet系统检测外周血中性粒细胞水平，免疫荧光及共聚焦显微镜检测脾及心肌组织中性粒细胞浸润水平、FPR1表达及定位共表达情况。TTC&蓝双染色法检测心肌梗死面积。　　研究结果：HemaVet检测结果显示，40分钟缺血小鼠再灌注时外周血中性粒细胞水平显著高于假手术组及20分钟缺血组；脾切除显著减少40分钟缺血组小鼠再灌注期外周血中性粒细胞水平；在20分钟缺血小鼠中，40-IHH显著增加再灌注时外周血中性粒细胞水平；而脾切除可以显著抑制40-IHH上调外周血中性粒细胞作用。免疫荧光检测结果显示，与20分钟心肌缺血小鼠相比40-IHH处理组或40分钟心肌缺血组再灌注后心肌组织中中性粒细胞浸润水平显著升高。脾切除可以显著降低40分钟缺血小鼠心肌组织中中性粒细胞浸润水平。免疫荧光显示，40-IHH显著增加脾脏组织中免疫细胞 FPR1受体表达水平；共聚焦显微镜观察到增加的 FPR1蛋白表达主要定位于中性粒细胞。cFLFLF处理组显著减少循环血及心肌组织中中性粒细胞水平，同时减轻40-IHH处理组心肌缺血再灌注损伤，减小心肌梗死面积。　　结论：心脏-脾轴介导了心肌缺血再灌注损伤后中性粒细胞活化及心肌浸润，从而加重再灌注心肌损伤。FPR1可以作为治疗靶点抑制心脏-脾轴介导的中性粒细胞活化，减轻心肌缺血再灌注损伤。　　第四部分内容：急性高血糖通过激活脾免疫炎症细胞增加缺血再灌注损伤后心肌梗死面积　　研究目的：急性高血糖显著增加非糖尿病患者急性心肌梗死及心脏手术患者死亡率，影响心脏功能。动物实验研究也发现急性高血糖可以显著增加再灌注损伤后心肌梗死面积，但其详细作用机制仍不清楚。有研究发现，急性高血糖可以显著激活免疫炎症细胞活性，促进全身炎症反应。前三部分内容我们已经证实脾脏在心肌缺血再灌注免疫损伤机制中的核心地位，在此基础上我们提出假设：急性高血糖可能通过激活脾免疫炎症细胞，促进再灌注阶段免疫炎症反应，加重心肌缺血再灌注损伤。本部分研究内容将在在体小鼠心肌缺血再灌注损伤模型中对这一假设加以验证。　　研究内容及方法：使用C57BL6小鼠建立心肌缺血再灌注损伤模型。第一部分实验结果提示，30分钟心肌缺血小鼠再灌注后形成显著心肌梗死，而脾切除对30分钟缺血小鼠再灌注损伤无显著影响。因此选取30分钟心肌缺血组小鼠作为本部分研究对象。急性高血糖处理组于心肌缺血前20分钟腹腔注射20%高糖（2ml/kg）。急性脾切除处理组小鼠在心肌缺血前30分钟切除脾脏。将脾脏分离成脾免疫细胞单细胞悬液，使用台盼蓝染色法判定脾免疫细胞活性。将5×106活脾免疫细胞静脉注入脾切除小鼠以重建脾免疫细胞。cFLFLF处理组小鼠于缺血前静脉注射特异性FPR1受体阻断剂cFLFLF（500μg/kg）。HemaVet系统检测外周血中性粒细胞水平。相应处理组取小鼠脾脏吸取表面液体后称重，免疫荧光检测小鼠脾脏及心脏中免疫细胞及FPR1水平。DHE探针检测小鼠脾脏及心脏活性氧簇水平。TTC&蓝双染色法检测心肌梗死面积。　　研究结果：急性高血糖显著增加30分钟心肌缺血小鼠再灌注后心肌梗死面积。脾切除可以显著阻断急性高血糖上述增加心肌梗死面积的作用。脾免疫细胞重建可以恢复急性高血糖增加心肌梗死面积作用。急性高血糖显著增加再灌注阶段外周血中性粒细胞水平，同样这一作用在脾切除小鼠模型中显著消失。急性高血糖小鼠再灌注后脾重量显著减轻，免疫荧光检测发现再灌注阶段高血糖组小鼠脾脏白髓边缘区中性粒细胞水平显著降低伴随着脾脏重量减低。急性高血糖组小鼠再灌注阶段心肌组织中中性粒细胞浸润显著增加。在无损伤小鼠中，急性高血糖显著增加脾免疫细胞活性氧簇水平，但对心肌组织中活性氧水平无显著影响。使用FPR1特异性阻断剂可以显著减轻急性高血糖导致的心肌损伤。　　结论：急性高血糖通过激活脾免疫炎症细胞，活化再灌注阶段中性粒细胞，促进心肌组织中中性粒细胞浸润，增加再灌注后心肌梗死面积。