浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells, pDC）是指一群来源于淋巴样干细胞的树突状细胞亚群,静息状态下形态与浆细胞相似,在IL-3和CD40L存在下可以分化为成熟的DC（m-DC）,表达TLR7、TLR9等胞内模式识别受体,识别双链RNA病毒、细菌和病毒DNA中的CpG基序以及由染色质DNA片断与抗核小体IgG2a型抗体形成的免疫复合物,一旦活化,能快速释放大量Ⅰ型干扰素,故也有学者称其为Ⅰ型干扰素生成细胞（type Ⅰ interferon-producing cells, IPC）,参与抗病毒免疫应答、维持免疫耐受及自身免疫性疾病的发生发展。近年来发现pDC尚具有多种免疫功能,参与NK细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、经典的髓系树突状细胞（myeloid DC, mDC/　classical DC, cDC）等多种免疫细胞的活化和诱导,从而防御外源性病原体病毒等的入侵,或打破机体的免疫耐受状态诱发自身免疫性疾病。因此了解如何影响pDC的分化、成熟及免疫功能具有重要意义,也是近五年来研究的焦点问题之一DC与内外源性危险信号相互作用后可以诱导其成熟,而其成熟状态可以决定DC提成抗原后的免疫反应类型。DC具有静息（resting DC, r-DC）,成熟（mature DC, m-DC）与活化（activated DC, a-DC）三种状态：r-DC高表达TLR,IgG Fc受体、C3b受体、甘露糖受体,低表达MHC Ⅰ类和Ⅱ类分子,摄取、加工抗原能力强而提呈抗原激发免疫应答能力弱；m-DC高表达MHC Ⅰ类和Ⅱ类分子、CD80/86、CD40、CD83、CD208,摄取、加工抗原能力弱,促进未分化T淋巴细胞增殖；a-DC高表达MHC Ⅰ类和Ⅱ类分子、CD80/86、CD40、CD83、CD208,分泌诱导T淋巴细胞极化的各种细胞因子,而启动适应性免疫应答。成熟活化的DC激活T淋巴细胞发生免疫应答,仍处于静息状态的未活化的DC通过失能、缺失和诱导生成调节性T淋巴细胞等机制诱导T淋巴细胞耐受。pDC暴露于外源性模式识别分子（如细菌和病毒DNA中的CpG基序或人工合成的CpG寡核苷酸）和/或内源性模式识别分子（即含自身核酸的免疫复合物）,能够迅速产生大量的Ⅰ型干扰素。而TLR7/TLR9介导的pDC的活化依赖MyD88-IRAK4-TRAF6复合物的形成和激活IRF-7,JNK, MAPK、NF-kB等相关信号通路,从而诱导pDC表面协同刺激分子的表达和炎性细胞因子IFN-α等的分泌。IFN-α还可以通过激活cDC,表达共刺激分子,并诱导单核细胞分化为moDC,激活自身免疫性CD4+和CD8+T淋巴细胞,与IL-6共同诱导自身反应性B淋巴细胞分化为成熟的浆细胞分泌自身抗体。IFN-a诱导细胞毒性T淋巴细胞杀死组织细胞,从而产生核小体和自身抗原片段,从而进一步加剧自身免疫病理生理过程。IFN-a也直接促进血管的异常发生,参与自身免疫性疾病的早期病变的形成。因此,如何能打破此恶性循环,重建免疫耐受将是治疗自身免疫性疾病的关键。胆囊收缩素（cholecystokinin, CCK）是一种典型的脑肠肽,和免疫调节肽。CCK存在着多种分子形式,八肽胆囊收缩素（cholecystokinin octapeptide, CCK-8）是体内含量最高且具有CCK全部生物活性的最小分子形式。它通过内分泌、旁分泌以及自分泌等多种方式作用于靶细胞,与CCK1受体（CCK-1R）或CCK2受体（CCK-2R）结合,介导相应的适应性细胞保护作用。CCK-1R属于G蛋白偶联受体家族,它偶联的是Gs或Gq/11蛋白系统,如果是Gs蛋白系统,激活腺苷酸环化酶活性,提高胞内cAMP水平,进一步激活PKA；如果是Gq/11蛋白系统则通过肌醇磷脂系统发挥作用。CCK2R属于G蛋白偶联受体家族,偶联的是Gq/11蛋白系统,它能激活磷脂酶C,使PIP2水解,产生IP3和DAG来进一步使细胞内[Ca2+]增加并激活PKC,最终产生生物学效应。本室前期工作显示CCK-8具有调节免疫细胞增殖、趋化、粘附、免疫杀伤等功能,但是其对免疫系统功能的调节机制仍存在许多悬而未决的问题,而且CCK-8能否通过调节DC功能进而影响适应性免疫应答,人外周血pDC细胞表面是否存在CCK1R/2R,CCK-8对pDC有何调节作用,国内外尚无人报道。基于以上原因,本课题以人外周血浆细胞样树突细胞为研究对象,从细胞内外受体及其与配体的结合为切入点,就以下问题进行研究：（1）人外周血pDC是否表达CCK受体；（2）若CCK受体在pDC有表达,CCK-8对pDC的成熟与分化有何影响；（3）若CCK1R和CCK2R在pDC均有表达,我们将模拟体内DC赖以生存的复杂的生物环境,并通过RNA干扰方法分别敲低两种受体的表达,探讨CCK-8调节人外周血pDC免疫功能的受体信号相关机制。1CCK受体在人外周血浆细胞样树突状细胞的表达目的：CCK-8通过与靶细胞膜表面表达的特异性受体CCK1R和CCK2R结合发挥作用。本室以往研究结果表明小鼠骨髓源性cDC表达CCK1R和CCK2R。但是人来源DC有无CCK1R和CCK2R表达,在不同的分化发育阶段有无变化还不清楚。本部分将研究CCK1R和CCK2R在静息、成熟和活化的人外周血pDC的表达。通过检测健康人外周血pDC在不同分化发育阶段其CCK受体的表达,为研究CCK-8对pDC成熟及活化的调节提供结构基础。方法：取新鲜分离的健康志愿者抗凝外周血白细胞,通过淋巴细胞分离液密度梯度离心,获得外周血单个核细胞（PBMC）,后将PBMC用免疫磁珠法分选纯化CD304（BDCA4）+pDC,获得pre-pDC,用流式细胞术鉴定CD303（BDCA2）+pre-pDC细胞纯度。经分选后的PBMC用完全培养基（含10%胎牛血清的RPM11640）重悬,按1×107细胞/孔铺于6孔板培养,37℃,5%二氧化碳细胞孵育箱内孵育2小时,用预温的培养基除去非贴壁细胞,贴壁细胞在含人重组GM-CSF（100ng/ml）和人重组IL-4（lOng/ml）和10%胎牛血清的RPM11640完全培养基中培养6天,获得人外周血cDC,用流式细胞仪分析CD1c+/CD12310w/CD303-cDC的纯度大于90%时可用于后面的实验。收集pDC、cDC及PBMC,提取细胞总RNA, RT-PCR检测CCK1R和CCK2RmRNA的表达；测序验证PCR产物的特异性。分选后的人外周血pre-pDC在含IL-3（10ng/ml）的RPM11640完全培养基中,370C5%CO2,培养4天,分化为静息状态的pDC（r-pDC）; r-pDC在含人重组CD40L（1μg/ml）的完全培养基中培养48h,分化为成熟状态的pDC（m-pDC）; m-pDC在含CpG ODN class A（ODN2216）或/和CpG class B（ODN2006）（5μ g/ml）的完全培养基中培养24h,分化为活化状态的pDC（a-pDC）。收集不同状态的pDC,提取细胞总RNA, RT-PCR检测不同状态的pDC CCK1R和CCK2RmRNA的表达；或经4%多聚甲醛固定后,分别加入一抗（兔抗人CCK1R抗体和鼠抗人CCK2R抗体）,二抗（FITC标记抗兔和texas red标记的抗鼠山羊IgG）,另外采用PBS代替一抗作阴性对照,PC12细胞做阳性对照细胞。最后甘油封片后,于荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察并照相,观察CCK1R和CCK2R蛋白的表达。结果：（1）CD304免疫磁珠分选纯化的CD303+pre-pDC纯度大于98%；经分选后的PBMC在含人重组GM-CSF（100ng/ml）和人重组IL-4（10ng/ml）的完全培养基中去悬浮培养6天,cDC纯度可达90%。（2）本研究首次发现健康人外周血pDC、cDC和PBMC均表达1型CCK受体和2型CCK受体,且两种受体有共定位现象。（3）CCK1R、CCK2R蛋白表达及CCK2RmRNA表达在m-pDC和a-pDC均增加（P>0.05VS r-pDC）,提示CCK-8系统可能参与了pDC的成熟与活化。结论：CCK-1R和CCK-2R在健康人外周血来源的浆细胞样树突状细胞表面和单核细胞来源的髓系树突状细胞中均有表达。CD40L诱导的成熟pDC CCK2R表达显著增高,CpG ODN诱导的活化pDC CCK1R和CCK2R表达均显著增高,而且两种受体在不同活化状态的pDC均有共定位现象。为进一步研究CCK-8对人外周血来源DC的调节作用提供了结构基础。2CCK-8对人外周血pDC成熟和活化的影响目的：本室以往研究结果表明CCK-8可以抑制LPS诱导的小鼠骨髓源性cDC的成熟与活化。但是,CCK-8对人来源DC的成熟与活化有无调节作用,对参与抗病毒免疫应答及自身免疫性疾病的发生发展的pDC的免疫功能有无影响,国内外尚无人报道。DC成熟过程中伴随细胞表型和功能的改变,本部分将直接用免疫磁珠分选法提取人外周血pDC进行培养,模拟体内pDC赖以生存的环境,给予多种刺激因素诱导pDC成熟活化,同时加入同种自体cDC和同种异体CD4+T淋巴细胞共同培养,观察外源性CCK-8对健康人外周血pDC表面协同刺激分子的表达,细胞因子的分泌以及激活适应性免疫应答等免疫功能的影响。方法：（1）CCK-8对CD40L诱导的人外周血pDC成熟标记CD208的表达的影响：pDC的分离与培养同上一部分。人重组CD40L诱导pDC成熟过程中伴随细胞表型和功能的改变,为观察外源CCK-8对CD40L诱导pDC表达成熟标记CD208的影响,分选纯化后的r-pDC,分为七组:control组；CD40L组；CD40L+CCK-8（10-10、10-9、10-8、10-7、10-6M）组。收集不同因素作用后的各组细胞,分别加入荧光标记的抗CD208的抗体,孵育30min,采用流式细胞术分析细胞表面CD208含量的变化。（2）CCK-8与PGE2共同作用对CD40L诱导的人外周血pDC表面协同刺激分子表达的影响：单核细胞、巨噬细胞及成纤维细胞均分泌前列腺素E2（PGE2）,所以pDC在体内成熟和活化过程中始终暴露在PGE2的环境中,因此本部分研究观察在存在或不存在PGE2的条件下,CCK-8对CD40L诱导的人外周血pDC表面协同刺激分子CD80、CD83、CD86、CD208及HLA-DR的表达。分选纯化后的r-pDC,分为五组：control组；CD40L组；CD40L+CCK-8（10-8M）组；CD40L+PGE2（10-7M）；CD40L+CCK-8（10-8M）+PGE2（10-7M）组。收集不同因素作用后的各组细胞,分别加入荧光标记的抗CD80、CD83、CD86、CD208及HLA-DR的抗体,孵育30min,采用流式细胞术分析pDC协同刺激分子的表达。（3）CCK-8体外作用对CpG ODN诱导的人外周血pDC活化的影响：CpG ODN诱导pDC活化过程中伴随细胞表型和功能的改变,本研究观察外源性CCK-8对CpG ODN诱导的pDC活化过程中协同刺激分子的表达,细胞因子的分泌,以及激活适应性免疫应答等免疫功能的影响。诱导纯化的r-pDC在含CpG ODN class A（ODN2216）和CpG class B（ODN2006）（5μ g/ml）的完全培养基中培养48h,同时加入外源性CCK-8（10-8M）,观察CCK-8对CpG ODN诱导的m-pDC的活化有何影响。实验分为三组：control组;cocktail （IL-3/CD40L/CpG ODN）组;cocktail+CCK-8（10-8M）组。收集不同因素作用后的各组细胞,分别加入荧光标记的抗CD208、和抗HLA-DR的抗体,孵育30min,采用流式细胞术分析细胞表面协同刺激分子含量的变化。收集不同因素作用后的各组细胞的培养上清,用ELISA法检测IFN-a的含量,RT-PCR检测IFN-a mRNA的表达。用免疫磁珠分选法从健康人外周血分离CD4+T细胞,按50：1,100：1,150：1数量比与上述各组树突状细胞体外共培养72h,采用MTT法测定CD4+T淋巴细胞的增殖。（4）CCK-8体外作用对LPS通过cDC间接诱导人外周血pDC活化的调节：近两年有研究报道pDC对LPS诱导的cDC的活化有协同效应,但在此过程中是否也伴随着pDC成熟状态的改变,鲜有报道。本研究观察在cDC存在的前提下,LPS作用能否激活pDC,以及外源性CCK-8对其有无影响。分选纯化后的r-pDC,分为五组：control （cDC与pDC以1：1比例共培养）组;cocktail （IL-3/LPS）+pDC组;cocktail+cDC组;cocktail+cDC+pDC（cDC与pDC以1：1比例共培养）组；cocktail+cDC+pDC+CCK-8（10-8M）组。收集不同因素作用后的各组细胞,分别加入荧光标记的抗CD208、和抗HLA-DR的抗体,孵育30min,采用流式细胞术分析细胞表面协同刺激分子含量的变化。收集不同因素作用后的各组细胞的培养上清,用ELISA法检测IFN-α的含量,RT-PCR检测IFN-α mRNA的表达。用免疫磁珠分选法从健康人外周血分离CD4+T细胞,按50：1,100：1,150：1数量比与上述各组树突状细胞体外共培养72h,采用MTT法测定CD4+T淋巴细胞的增殖。（5）外源性CCK-8与炎症介质PGE2体外共同作用对人外周血pDC活化的影响：CpG ODN诱导pDC活化过程中伴随细胞表型和功能的改变,本研究观察外源性CCK-8与炎症介质PGE2体外共同作用对CpG ODN诱导pDC活化过程中细胞表型（HLA-DR、CD208）表达,细胞因子的分泌以及激活适应性免疫应答等免疫功能的影响。分选纯化后的r-pDC,分为四组：control组;cocktail （IL-3/CD40L/CpG ODN classA/classA B）组;cocktail+CCK-8（10-8M）组;cocktail+PGE2（10-7M）组;cocktail+PGE2（10-7M）+CCK-8（10-8M）组。收集不同因素作用后的各组细胞,分别加入荧光标记的抗CD208、和抗HLA-DR的抗体,孵育30min,采用流式细胞术分析细胞表面协同刺激分子含量的变化。收集不同因素作用后的各组细胞的培养上清,用ELISA法检测IFN-α的含量。用免疫磁珠分选法从健康人外周血分离CD4+T淋巴细胞,按50：1,100：1,150：1数量比与上述各组树突状细胞体外共培养72h,用ELISA法检测IFN-Y、IL-17的含量,采用MTT法测定CD4+T淋巴细胞的增殖。数据用mean±SD表示,用SPSS统计分析软件进行统计学分析,各组均数的比较行单因素方差分析（ANOVA）,用最小显著差法（least significant difference, LSD）作两两比较,P<0.05为有显著性差异。结果：（1）CCK-8剂量依赖性抑制CD40L诱导pDC成熟标记CD208的表达,其中10-7M和10-8M CCK-8作用最强（P<0.05vsCD40L组）。（2）未经CD40L诱导的r-pDC表达较低水平的CD80、CD86及HLA-DR,基本不表达成熟标记CD208；经CD40L诱导的m-pDC成熟标记CD208的表达和协同刺激分子CD80、CD86和HLA-DR的表达显著增高（P<0.05）,CD83略有增加但无统计学意义（P>0.05结果未给出）,CCK-8（10-8M）可以抑制CD40L诱导的m-pDC CD208及CD80、CD86和HLA-DR的表达,提示CCK-8可抑制CD40L诱导的m-pDC表型成熟；PGE2（10-7M）可以促进CD40L诱导的m-pDC表达CD208、CD80、CD86和HLA-DR。然而CCK-8（10-8M）与PGE2（10-7M）共同作用,对CD40L诱导的m-pDC协同刺激分子CD80、CD86和HLA-DR的表达无影响（P>0.05vsCD40L组）,但能抑制PGE2（10-7M）对CD40L诱导的m-pDC协同刺激分子表达的促进作用。（3）CpG ODN诱导的a-pDC作为APC能显著诱导同种异体CD4+T淋巴细胞增殖,促进IFN-α的合成和分泌及CD208和HLA-DR的表达,CCK-8（10-8M）与CpG ODN同时作用后则明显降低a-pDC的刺激能力,同时CD4+T淋巴细胞的增殖活性也明显下降（P<0.05）。（4）本研究发现单纯LPS作用于健康人外周血r-pDC,对CD208和HLA-DR的表达,CD4+T淋巴细胞的增殖,以及IFN-a的分泌均无明显影响（P>0.05）,即单纯LPS作用不能诱导健康人外周血r-pDC的成熟与活化；但在pDC与cDC（pDC:cDC=1:1）共存情况下,LPS可以诱导CD208和HLA-DR高表达（P>0.05vs LPS+cDC组）,且gate%值大于50%,同时,共培养上清中IFN-a的含量明显增加,提示LPS可以间接诱导pDC表型的成熟和IFN-α的分泌；一定浓度的CCK-8（10-8M）与LPS共同作用可以抑制LPS通过cDC间接诱导的pDC的IFN-α的分泌。（5）PGE2是体内重要的炎症介质,本研究发现PGE2可以促进CpG ODN诱导的pDC的成熟活化,并刺激CD4+T细胞产生高水平IFN-Y和IL-17,一定浓度的CCK-8显著抑制了CpGODN诱导的IFN-α的分泌,并降低了混合培养上清中CD4+T细胞产生的IFN-γ和IL-17的水平（P<0.05）,CCK-8与PGE2共同作用a-pDC,显著抑制了PGE2对pDC活化的促进作用,但与CpG ODN组比无统计学意义。结论：体外CCK-8单独作用,可以抑制CD40L诱导的pDC表型成熟,但在PGE2存在的条件下CCK-8对CD40L诱导的m-pDC表型成熟无明显影响；体外CCK-8单独作用,可以抑制CD40L和CpG ODN联合诱导的pDC表型的成熟,IFN-α的合成与分泌,及诱导同种异体CD4+T淋巴细胞增殖的能力；单纯LPS作用不能诱导健康人外周血pDC的成熟与活化,LPS可以通过cDC间接诱导pDC表型的成熟和IFN-α的分泌；一定浓度的CCK-8（10-8M）与LPS共同作用可以抑制LPS通过cDC间接诱导的pDC分泌IFN-α；PGE2可以促进CD40L联合CpG ODN诱导的pDC的成熟和活化,进而诱导CD4+T淋巴细胞的增殖与极化；一定浓度的CCK-8,显著抑制了PGE2对CD40L、CpG ODN诱导的pDC的成熟和活化的促进作用,并降低了CD4+T淋巴细胞的增殖能力和混合培养上清中IFN-Y和IL-17的水平。综合分析这些实验结果,提示CCK-8可以调节CD40L、CpG ODN和LPS+cDC诱导的pDC成熟活化过程中协同刺激分子的表达和细胞因子IFN-α的分泌,对同种异体CD4+T细胞的增殖和分化具有一定的调节作用。3慢病毒介导的CCK1R或CCK2R基因沉默对CpG ODN诱导的人外周血浆细胞样树突状细胞活化的影响目的：上述结果证明pDC同时表达CCK-8特异性受体CCK1R和CCK2R,且CCK-8体外作用于pDC,能调节CD40L、CpG ODN和LPS+cDC诱导的pDC成熟和活化,影响pDC表面协同刺激分子的表达和前炎性细胞因子IFN-α的分泌,进而影响同种异体CD4+T淋巴细胞的增殖和分化。然而CCK-8对pDC免疫功能的调节是非特异性反应,还是通过CCK-8的特异性受体CCK1R和CCK2R发挥其调节作用,以及相关的受体信号转导机制均尚未阐明。本研究首次系统探讨了CCK-8对健康人外周血来源的浆细胞样树突状细胞成熟和活化的影响,并将从受体、蛋白激酶、核转录因子多个环节对其相关信号转导机制进行了阐述。方法：（1）构建CCK1R和CCK2RmiRNA重组慢病毒表达载体：慢病毒载体（Lentiviral vector, LV）是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统,它既可感染分裂细胞,也可感染非分裂细胞,还具有整合到宿主细胞基因组、稳定长效转染、感染效率高等优点,能高效将目的基因（或RNAi）导入动物和人的原代细胞或细胞系。CCK1R和CCK2R干扰慢病毒载体的构建分三个阶段：amiRNA干扰载体构建根据Human CCKAR, NM₀00730.2和Human CCKBR,NM176875.2两个靶基因序列,分别设计并合成一套miRNA干扰序列,每个基因设计合成四对oligo,共八对,并将退火后的序列亚克隆到pcDNA6.2TM-GW/EmGFP-miR载体中（本部分实验由invitrogen公司协助完成）。每个转化平板分别挑取4个克隆,摇菌抽提质粒后进行测序（pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR的反向测序引物5’-CTCTAGATCAACCACTTTGT-3’）,以验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的寡聚单链DNA序列一致。b有效干扰片段的筛选正常生长的SH-SY5Y细胞（我们使用的细胞是用DMEM培养基+10%FBS,细胞已经发生一定程度的分化）在转染前一天按80%左右的密度铺到6孔板中（细胞浓度为5X105cells/ml）。12h后,用LipofectamineTM2000转入相应的质粒,包括miRNA-control（空载）、CCK-1R-mi1、CCK-1R-mi2、CCK-1R-mi3、CCK-1R-mi4、CCK-2R-mi1、CCK-2R-mi2、CCK-2R-mi3、CCK-2R-mi4,72小时后利用显微镜观察细胞状态,并利用荧光显微镜观察荧光强度（质粒携带EGFP荧光标记）。在转染72h后的细胞中加入10ug/ml的blasticidin。并用未做任何处理的正常细胞作为负对照,筛选14天后,撤消选择压力,将成堆的克隆重新消化下来,铺到新的小盘中,待细胞长到足够多的时候,利用荧光显微镜观察荧光强度,之后每组分别各取出一部分用Trizol和蛋白裂解液裂解,Real-time PCR检测CCK1R/CCK2RmRNA变化,Western Blot检测二者蛋白表达的变化,以检测CCK1R和CCK2R的敲减效果。应用MTT法检测转染重组质粒pcDNA6.2TM-GW/EmGFP-CCK1R/2R-miRNA后细胞活性的变化。c慢病毒载体构建与慢病毒包装将筛选到的最有效的2个miRNA干扰载体分别和pDONR221载体进行BP重组反应,以获得含干扰序列的入门载体。将含干扰序列的入门载体和慢病毒目的载体pLenti6.3/V5-DEST进行LR重组反应,以获得含干扰序列的慢病毒表达载体。然后将含干扰序列的慢病毒表达载体转染293T细胞,包装病毒,测定病毒活性滴度（慢病毒的包装由invitrogen公司协助完成）。（2）慢病毒介导的CCK1R和CCK2R基因沉默对人外周血pDC成熟活化的影响：本研究观察慢病毒介导的CCK1R或CCK2R基因沉默对CD40L、CpG ODN诱导pDC成熟活化过程中协同刺激分子的表达,细胞因子的分泌以及激活适应性免疫应答等免疫功能的影响。分选纯化后的r-pDC,分为六组：control组;cocktail （IL-3/CD40L/CpG ODN class A/B）组;cocktail+慢病毒载体对照组；cocktail+慢病毒载体对照+CCK-8（10-8M）组；cocktail+CCK-8（10-8M）+LV-miR-CCK1R组;cocktail+CCK-8（10-8M）+LV-miR-CCK2R组。收集不同因素作用后的各组细胞,分别加入荧光标记的抗CD208抗体,孵育30min,采用流式细胞术分析细胞表面CD208含量的变化。RT-PCR检测IFN-a/CCR7mRNA的表达。收集不同因素作用后的各组细胞的培养上清,用ELISA法检测IFN-a的含量。用免疫磁珠分选法从健康人外周血分离CD4+T细胞,按50：1数量比与上述各组pDC体外共培养72h,用ELISA法检测IFN-Y、IL-17的含量,采用MTT法测定CD4+T淋巴细胞增殖程度以反映pDC的协同刺激活性。（3）CCK-8对CD40L和CpG ODN诱导的pDC成熟活化过程中PKA/PKC活性的影响：分选纯化后人外周血r-pDC,分为六组：control组;cocktail （IL-3/CD40L/CpG ODN class A/B）组；cocktail+慢病毒载体对照组；cocktail+慢病毒载体对照+CCK-8（10-8M）组；cocktail+CCK-8（10-8M）+LV-miR-CCK1R组;cocktail+CCK-8（10-8M）+LV-miR-CCK2R组。使用试剂盒Protein Kinase A Activity Assay Kit （Enzo Life Sciences, EKS-390A）检测pDC内PKA活性,用试剂盒Protein Kinase C Activity Assay Kit （Enzo Life Sciences,EKS-420A）检测pDC内PKA活性。（4）CCK-8对CD40L和CpG ODN诱导的a-pDC成熟活化过程中TRAF6、IRF7、p-IRF7表达的影响：分选纯化后人外周血r-pDC,分为六组：control组;cocktail（IL-3/CD40L/CpGODN class A/B）组;cocktail+慢病毒载体对照组；cocktail+慢病毒载体对照+CCK-8（10-8M）组；cocktail+CCK-8（10-8M）+LV-miR-CCK1R组;cocktail+CCK-8（10-8M）+LV-miR-CCK2R组。用in-cell Western blot技术检测pDC内TRAF6、IRF7、p-IRF7的表达。数据用mean±SD表示,用SPSS统计分析软件进行统计学分析,各组均数的比较行单因素方差分析（ANOVA）,用最小显著差法（least significant difference, LSD）作两两比较,P<0.05为有显著性差异。结果：（1）测序结果证明靶向CCK-1R和CCK-2R基因的八对重组质粒载体pcDNA6.2TM-GW/EmGFP-miRNA构建成功；（2）其中,编号为CCK-1R-mi2的pcDNA6.2TM-GW/EmGFP-miRNA重组质粒载体对细胞CCK1RmRNA表达的抑制作用最为显著,抑制率为64.05%,与正常对照组相比具有明显差异（P<0.05）。Western blot检测结果显示,CCK-1R-mi2对靶基因蛋白表达抑制作用最明显,CCK1R基因蛋白表达抑制率为61.18%,与正常对照组相比具有明显差异（P<0.05）。（3）编号为CCK-2R-mi2的pcDNA6.2TM-GW/EmGFP-miRNA重组质粒载体对细胞CCK2RmRNA表达的抑制作用最为显著,抑制率为66.25%,与正常对照组相比具有明显差异（P<0.05）。Western blot检测结果显示,CCK-2R-mi2对靶基因蛋白表达抑制作用最明显,CCK2R基因蛋白表达抑制率为60.08%,与正常对照组相比具有明显差异（P<0.05）。为研究CCKR对人外周血浆细胞样树突状细胞成熟和活化的调控作用奠定基础。（4）MTT检测结果显示,重组质粒pcDNA6.2TM-GW/EmGFP-CCK2R-miRNA能显著促进SH-SY5Y细胞的增殖活性,与正常对照组相比有显著差异（P<0.05）。（5）预先将Lenti6.3-X102载体对照重组慢病毒（MOI值：100）转染至r-pDC,72h后再给予cocktail刺激诱导,pDC表面分子CD208的表达及IFN-α的分泌,与单独cocktail刺激诱导组比无明显差异（P>0.05）。CCK-8组和慢病毒对照载体单独作用对pDC表面分子CD208的表达及IFN-α的分泌无明显影响。（6）CCK-8可明显抑制CD40L和CpG ODN诱导的pDC成熟活化过程中CD208的表达和IFN-α的分泌。预先将LV-miR-CCK1R或LV-miR-CCK2R重组慢病毒（MOI值：100）转染至r-pDC,72h后再给予cocktail+CCK-8刺激诱导,cocktail+CCK-8（10-8M）+LV-miR-CCK2R组pDC表面分子CD208的表达及IFN-α的分泌,与单独cocktail+CCK-8组比明显升高（P<0.05）,可以明显逆转CCK-8的抑制效应。但cocktail+CCK-8（10-8M）+LV-miR-CCK1R组表现出较弱的逆转作用。（7）在静息状态下,单纯CCK-8（10-8M）组和Lenti6.3重组慢病毒载体对照组pDC内PKC与PKA的活性略有升降,但无显著性差异（P>0.05）;cocktail （IL-3/CD40L/CpG ODN class A/B）组pDC内PKC与PKA的活性较control组明显升高（P<0.05）；CCK-8可显著抑制cocktail组诱导的PKC活性的升高,而促进cocktail组诱导的PKA活性的升高；经慢病毒载体转染（转染方法同上）,靶向敲低CCK1R后,对CCK-8诱导的PKC的抑制效应和对PKA的促进效应略有下调,但无统计学意义（P>0.05）；靶向敲低CCK2R后,可以明显逆转CCK-8对PKC的抑制效应和对PKA的促进效应。（8）在静息状态下,CCK-8和Lenti6.3重组慢病毒对照载体单独作用,对pDC内TRAF6、IRF7、p-IRF7的表达无明显影响（P>0.05）；cocktail （IL-3/CD40L/CpG ODN class A/B）组pDC内TRAF6、IRF7、p-IRF7的表达较control组明显升高（P<0.05）；CCK-8可显著抑制cocktail组诱导的TRAF6、IRF7、p-IRF7的表达的升高；靶向敲低CCK1R后,几乎不可以逆转CCK-8对TRAF6、IRF7、p-IRF7表达的抑制效应,与cocktail+CCK-8组比无统计学意义（P>0.05）；靶向敲低CCK2R后,可以明显逆转CCK-8对TRAF6、IRF7、p-IRF7表达的抑制效应（P<0.05）。结论：本实验通过制备pDC成熟和活化的体内环境模型,在细胞水平模拟体内复杂的内环境,给予多重刺激因素诱导健康人外周血pDC成熟和活化,以改以往的单因素作用对细胞的影响,忽视了体内多因素参与的背景条件。CCK-8在不同条件下均可不同程度调节人外周血来源的浆细胞样树突状细胞的成熟活化状态,敲低CCK2R的表达可以逆转CCK-8对pDC的调节作用。CCK-8可抑制人外周血来源的浆细胞样树突状细胞活化过程中TRAF6、IRF7以及磷酸化的IRF7的表达增加,从而抑制人外周血来源的浆细胞样树突状细胞的活化,敲低CCK2R的表达可以逆转CCK-8的抑制作用。PKA通路和PKC通路共同参与了CCK-8对人外周血来源的浆细胞样树突状细胞活化的调节。提示CCK-8可以成为一些与人外周血来源的浆细胞样树突状细胞过度活化有关的自身免疫性疾病的潜在治疗因子,CCK-CCKR-PKA/PKC与TLR-MyD88-TRAF6-IRF7二条通路间的Cross-talk可能是CCK发挥抗炎作用的机制之一。