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前言 细胞周期是细胞生命活动的基本过程。近年来发现细胞周期素（Cyclin）、细胞周期蛋白依赖激酶（Cyclin dependent kinase，CDK）和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（Cyclin dependent kinase inhibitor，CKI）在真核生物细胞周期调控有重要作用。P21WAF1是一种CKI，它可与多种cyclin／CDK复合物结合，引起细胞周期阻滞。 细胞凋亡的发生、发展可被一系列基因所调控，其中包括许多癌基因和抑癌基因，如Rb、bcl-2和caspase等。Rb是抑癌基因，其表达产物Rb蛋白在细胞核内与控制DNA复制和转录的蛋白相结合，从而控制细胞的生命过程。Bcl-2的表达产物位于线粒体内膜、核膜及内质网膜，它可通过对脂质过氧化的抑制作用而发挥其抑制细胞凋亡的功能。Caspase属于半胱氨酸蛋白酶，多种恶性肿瘤的凋亡机制都涉及caspase家族的激活，最终导致细胞凋亡。 蟾蜍灵是中药蟾酥的主要有效成分，研究表明它可引起肿瘤细胞的周期阻滞和凋亡。本实验室的前期工作观察到蟾蜍灵可抑制人类白血病细胞HL-60、K562和NB4细胞的增殖，增强ATRA对NB4及APL原代培养细胞的诱导分化作用，诱导HL60、K562和NB4细胞的凋亡，引起K562细胞G2／M期、OVCAR3细胞M期阻滞，下调HL60细胞bcl-2蛋白及K562细胞WT1mRNA和蛋白的表达，但其抗肿瘤的确切机制目前尚不明确。 为了进一步研究蟾蜍灵作用的机制，我们研究了蟾蜍灵对乳腺癌MCF-7细胞周期阻滞和凋亡的作用。 实验材料与方法 一、实验材料 试剂与实验仪器：蟾蜍灵购于Sigma公司；碘化丙啶（PI）、RNAse购于Fluka公司；免疫组化抗体鼠抗人p21、pBb、bcl-2、caspase-9购于迈新公司（Maixin-Bio）；RPMI-1640购于GIBCO BBL USA公司；胎牛血清购于天津血液病研究所。 二、实验方法 1.细胞培养:乳腺癌细胞系MCF一7细胞购自天津血液病研究所，按本实验室培养常规，生长于含有56℃、30分钟灭活后的10%胎牛血清和12U/L庆大霉素的RPMI一1640培养液中，于37℃、5%co:、饱和湿度的培养箱内传代培养。所有实验均采用对数生长期细胞。 2.细胞增殖测定:细胞增殖活力测定采用MTT法。 3.细胞形态学变化和凋亡的检测:采用瑞士一吉姆萨染色进行形态学分析。 4.细胞周期测定:应用流式细胞仪进行细胞周期解析。 5.细胞周期和凋亡相关蛋白的检测:采用免疫组化法检侧解l、pRb、玩l一2、Caspase一9蛋白的表达。 6.统计学处理:所用数据为三次独立实验的平均值，数据处理采用sPss统计学软件进行t检验和xZ检验及方差分析。结果 一、蟾赊灵对MCF一7细胞增殖的抑制作用 蟾赊灵以时间、剂量依赖的方式抑制MCF一7细胞的增殖。24、48b的IC，分别为80.5、58.3皿ol/L 二、蟾蛛灵诱导M CF一7细胞周期阻滞和凋亡 10一loonln心L的蟾蛛灵作用24h后观察形态学上的改变，可见细胞体积增大，多倍体细胞多见;l以X)恤。FL的蟾蛛灵作用24h可见胞体完整，胞核浓缩或碎裂。 三、蟾蛛灵诱导MCF一7细胞发生cZ/M阻滞 经不同浓度的蟾蛛灵处理后，流式细胞仪检侧显示MCF一7细胞发生q/M期阻滞，其中1 oonmol/L的蟾蛛灵处理48h后，几/M期细胞所占的比例由对照组的17 .5%增加到37.2%，C衬G，期所占比例逐渐减少。 四、蟾蛛灵诱导周期和凋亡相关蛋白解1、p孙钾解钾韶一9蛋白表达上调，bcl一2蛋白表达下调。 10一loonmOFL浓度的蟾蛛灵作用0一48h，可见解1阳性的MCF一7细胞的阳性程度增加，位于细胞核的pRb、位于细胞浆的Ca‘p皿此一9蛋白的表达随着浓度和时间的延长而逐渐增高，表现为免疫组化染色由浅揭色到深揭色，而位于胞浆的喊一2的表达逐渐降低，组化染色由深揭色到浅揭色。结论 1.姗蛛灵以时间、剂量依赖方式抑制MCF一7细胞的增殖。 2.蟾蛛灵在低浓度时诱导MCF一7细胞周期阻滞，高浓度时诱导MCF一7细胞凋亡。 3.蟾蛛灵诱导MCF一7细胞发生GZ/M期阻滞。 4.蟾蛛灵上调周期和凋亡相关蛋白解1、pRb、朋s钾既一9的表达，下调械一2的表达。 上述研究结果为深人研究细胞周期阻滞和凋亡及蜡蛛灵的作用机理和应用蟾蛛灵进行肿瘤治疗提供了重要的科学依据。