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研究目的
局部晚期及转移性宫颈癌治疗手段有限，预后不佳，给女性的生命健康带来了极大的威胁。我们前期研究发现Tie1(Tyrosine kinase with Ig and EGF homology domains 1)在宫颈癌上皮中表达显著升高，本课题旨在进一步明确Tie1在宫颈癌中的表达及作用，探讨其影响宫颈癌恶性生物学行为的具体机制，研究Tie1表达升高的上游调控分子，为改善宫颈癌的靶向治疗寻找新的线索。
研究方法
1.利用GEO及TCGA公共数据库，分析宫颈癌中Tie1的基因及RNA水平的改变，研究Tie1水平与患者生存预后的关系。
2.蛋白免疫印迹实验(Western Blot)检测Tie1在宫颈癌细胞系SiHa、HeLa、CaSki和C33A中的表达，免疫荧光实验明确Tie1在宫颈癌细胞中的亚细胞定位。
3.SiHa和HeLa细胞中，利用慢病毒载体构建稳定过表达Tie1的细胞SiHaLV-TIE1和HeLaLV-TIE1，相应的空白对照为SiHaLV-Ctrl和HeLaLV-Ctrl。利用WesternBlot检测Tie1的表达，验证过表达效率。
4.SiHaLV-TIE1/Ctrl和HeLaLV-TIE1/Ctrl细胞中，利用平板克隆形成实验和EdU实验检测细胞的增殖能力；成球实验检测细胞干性；Transwell侵袭实验和划痕实验分别检测细胞的侵袭和迁移能力。
5.SiHa和HeLa细胞中，免疫荧光检测宫颈癌中磷酸化Tie1的表达和亚细胞定位。
6.SiHa和HeLa细胞中，给予不同时间梯度的人源重组血管生成素1(Recombinant Human Angiopoietin-1 Protein，hAng1)刺激，利用WesternBlot实验检测磷酸化Tie1的水平。
7.SiHaLV-TIE1/Ctrl和HeLaLV-TIE1/Ctrl细胞中，给予Tie2特异性激酶抑制剂，Transwell侵袭实验和划痕实验分别检测细胞的侵袭和迁移能力。
8.HeLa细胞中利用慢病毒过表达带有FLAG标签蛋白的Tie1，利用FLAG抗体进行蛋白免疫沉淀，下拉与Tie1结合的蛋白复合物。利用考马斯亮蓝染色以及WesternBlot实验验证免疫共沉淀的效率及特异性，并由液相二级质谱(Liquid chromatograph-mass spectrometer/Mass spectrometer, LC-MS/MS)对Tie1结合蛋白进行定性和定量分析。通过差异表达分析，筛选获得Tie1可能的结合蛋白进行下一步研究。利用生物信息学分析Tie1结合蛋白在GO和KEGG数据库中的通路富集情况。
9.HeLa细胞中利用免疫共沉淀检测Tie1和Basigin的内源性结合。
10.HeLaLV-TIE1/Ctrl细胞中，利用WesternBlot检测Basigin及其下游基因基质金属蛋白酶(Matrix MetalloProteinases,MMPs)的表达水平。
11.HeLaLV-TIE1/Ctrl细胞中，给予不同时间梯度放线菌酮(Cycloheximide, CHX)处理，阻断蛋白合成。WesternBlot实验检测各时间点Basigin的蛋白水平。
12.TCGA数据库中分析Tie1与MMP家族基因RNA水平的相关性。
13.SiHaLV-TIE1/Ctrl和HeLaLV-TIE1/Ctrl细胞中，给予Basigin抑制性抗体，阻断其功能。Transwell侵袭实验和划痕实验分别检测细胞的侵袭和迁移能力。
14.收集宫颈癌患者手术标本，利用激光显微切割技术(Laser capture microdissection, LCM)获取35例宫颈癌上皮组织和19例正常宫颈上皮组织。逆转录实时荧光定量PCR(Reverse transcription-Quantitative Realtime PCR, RT-qPCR)检测Tie1反义长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)Tie1-AS的表达，并在35例宫颈癌样本中，分析lncRNATie1-AS的水平与临床病理特征的关系。
15.以液基细胞学正常的宫颈刷片样本为对照，RT-qPCR检测SiHa、HeLa及C33A细胞中lncRNATie1-AS的水平。
16.SiHa、HeLa及C33A细胞中，梯度离心法分离细胞核和细胞质组分，RT-qPCR检测各组分lncRNATie1-AS的水平，确定其亚细胞定位。
17.SiHa和HeLa细胞中，利用质粒转染过表达lncRNATie1-AS。RT-qPCR检测过表达效率。Transwell侵袭实验和划痕实验分别检测细胞的侵袭和迁移能力。EdU实验检测细胞的增殖能力。
18.HeLa细胞中转染lncRNATie1-AS过表达质粒或小干扰RNA(Small interfering RNA, siRNA)，RT-qPCR验证过表达或敲除效率。RT-qPCR检测Tie1RNA水平；利用WesternBlot和免疫荧光检测Tie1蛋白水平。给予不同时间梯度的鹅膏蕈碱，阻断RNA合成，RT-qPCR检测各时间点Tie1RNA水平。
19.LCM的宫颈癌组织标本中，RT-qPCR检测Tie1RNA水平，分析lncRNATie1-AS和Tie1RNA水平相关性。
20.HeLa细胞中利用质粒过表达lncRNATie1-AS，RT-qPCR检测其六个邻近基因KDM4A、CDC20、YBX1、EDN2、PRPRF和SLC2A1的RNA水平。
21.LCM的宫颈癌组织标本中，RT-qPCR检测上述六个邻近基因的表达，分析lncRNATie1-AS和它们mRNA水平相关性。
22.SiHa和HeLa中利用质粒共转染同时上调lncRNATie1-AS和Tie1，Transwell侵袭实验和划痕实验分别检测细胞的侵袭和迁移能力。
研究结果
1.和正常宫颈上皮相比，Tie1在宫颈癌上皮组织中表达增高，且主要分布在细胞膜和细胞质中。TCGA数据库分析显示Tie1高表达与宫颈癌的不良预后密切相关。体外细胞实验表明上调Tie1后，宫颈癌细胞的迁移侵袭能力增强，但细胞增殖及干性无明显改变。
2.宫颈癌细胞中Tie1基础磷酸化水平较低，hAng1刺激不能显著增强Tie1的磷酸化。
3.SiHa和HeLa细胞中，Tie2激酶抑制剂不能逆转Tie1促进侵袭迁移的作用。
4.质谱鉴定得到Tie1结合蛋白1128个，经差异表达分析筛选获得了169个目标蛋白。通过对蛋白的结构和功能进行分析，确定Basigin为Tie1可能的下游分子。生物信息学分析显示，GO数据库中，Tie1结合蛋白(n=169)在正向调控细胞迁移的通路中富集；KEGG数据库中Tie1结合蛋白显著富集在HPV感染以及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)等多种信号通路中。
5.Tie1与Basigin存在结合，且上调Tie1能减弱Basigin的降解，促进Basigin及其下游的MMP2和MMP9的表达。Basigin功能抑制性抗体可以逆转Tie1促进侵袭迁移作用。
6.和正常宫颈上皮相比，lncRNATie1-AS在宫颈癌上皮组织中低表达，且主要位于细胞核。体外细胞实验表明上调lncRNATie1-AS后，宫颈癌细胞的侵袭迁移被抑制，但对细胞的增殖没有明显影响。
7.LncRNATie1-AS能负向调控Tie1的水平，并降低Tie1RNA的稳定性。过表达Tie1可以逆转Tie1-AS抑制侵袭迁移的作用。虽然lncRNATie1-AS主要位于细胞核，但并不影响其邻近基因的表达水平。
结论
宫颈癌中,lncRNATie1-AS低表达能介导Tie1水平升高。Tie1通过与膜蛋白Basigin结合减少其降解，增强了Basigin及其下游信号通路MMP家族蛋白的表达，从而促进了宫颈癌细胞的迁移侵袭。
局部晚期及转移性宫颈癌治疗手段有限，预后不佳，给女性的生命健康带来了极大的威胁。我们前期研究发现Tie1(Tyrosine kinase with Ig and EGF homology domains 1)在宫颈癌上皮中表达显著升高，本课题旨在进一步明确Tie1在宫颈癌中的表达及作用，探讨其影响宫颈癌恶性生物学行为的具体机制，研究Tie1表达升高的上游调控分子，为改善宫颈癌的靶向治疗寻找新的线索。
研究方法
1.利用GEO及TCGA公共数据库，分析宫颈癌中Tie1的基因及RNA水平的改变，研究Tie1水平与患者生存预后的关系。
2.蛋白免疫印迹实验(Western Blot)检测Tie1在宫颈癌细胞系SiHa、HeLa、CaSki和C33A中的表达，免疫荧光实验明确Tie1在宫颈癌细胞中的亚细胞定位。
3.SiHa和HeLa细胞中，利用慢病毒载体构建稳定过表达Tie1的细胞SiHaLV-TIE1和HeLaLV-TIE1，相应的空白对照为SiHaLV-Ctrl和HeLaLV-Ctrl。利用WesternBlot检测Tie1的表达，验证过表达效率。
4.SiHaLV-TIE1/Ctrl和HeLaLV-TIE1/Ctrl细胞中，利用平板克隆形成实验和EdU实验检测细胞的增殖能力；成球实验检测细胞干性；Transwell侵袭实验和划痕实验分别检测细胞的侵袭和迁移能力。
5.SiHa和HeLa细胞中，免疫荧光检测宫颈癌中磷酸化Tie1的表达和亚细胞定位。
6.SiHa和HeLa细胞中，给予不同时间梯度的人源重组血管生成素1(Recombinant Human Angiopoietin-1 Protein，hAng1)刺激，利用WesternBlot实验检测磷酸化Tie1的水平。
7.SiHaLV-TIE1/Ctrl和HeLaLV-TIE1/Ctrl细胞中，给予Tie2特异性激酶抑制剂，Transwell侵袭实验和划痕实验分别检测细胞的侵袭和迁移能力。
8.HeLa细胞中利用慢病毒过表达带有FLAG标签蛋白的Tie1，利用FLAG抗体进行蛋白免疫沉淀，下拉与Tie1结合的蛋白复合物。利用考马斯亮蓝染色以及WesternBlot实验验证免疫共沉淀的效率及特异性，并由液相二级质谱(Liquid chromatograph-mass spectrometer/Mass spectrometer, LC-MS/MS)对Tie1结合蛋白进行定性和定量分析。通过差异表达分析，筛选获得Tie1可能的结合蛋白进行下一步研究。利用生物信息学分析Tie1结合蛋白在GO和KEGG数据库中的通路富集情况。
9.HeLa细胞中利用免疫共沉淀检测Tie1和Basigin的内源性结合。
10.HeLaLV-TIE1/Ctrl细胞中，利用WesternBlot检测Basigin及其下游基因基质金属蛋白酶(Matrix MetalloProteinases,MMPs)的表达水平。
11.HeLaLV-TIE1/Ctrl细胞中，给予不同时间梯度放线菌酮(Cycloheximide, CHX)处理，阻断蛋白合成。WesternBlot实验检测各时间点Basigin的蛋白水平。
12.TCGA数据库中分析Tie1与MMP家族基因RNA水平的相关性。
13.SiHaLV-TIE1/Ctrl和HeLaLV-TIE1/Ctrl细胞中，给予Basigin抑制性抗体，阻断其功能。Transwell侵袭实验和划痕实验分别检测细胞的侵袭和迁移能力。
14.收集宫颈癌患者手术标本，利用激光显微切割技术(Laser capture microdissection, LCM)获取35例宫颈癌上皮组织和19例正常宫颈上皮组织。逆转录实时荧光定量PCR(Reverse transcription-Quantitative Realtime PCR, RT-qPCR)检测Tie1反义长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)Tie1-AS的表达，并在35例宫颈癌样本中，分析lncRNATie1-AS的水平与临床病理特征的关系。
15.以液基细胞学正常的宫颈刷片样本为对照，RT-qPCR检测SiHa、HeLa及C33A细胞中lncRNATie1-AS的水平。
16.SiHa、HeLa及C33A细胞中，梯度离心法分离细胞核和细胞质组分，RT-qPCR检测各组分lncRNATie1-AS的水平，确定其亚细胞定位。
17.SiHa和HeLa细胞中，利用质粒转染过表达lncRNATie1-AS。RT-qPCR检测过表达效率。Transwell侵袭实验和划痕实验分别检测细胞的侵袭和迁移能力。EdU实验检测细胞的增殖能力。
18.HeLa细胞中转染lncRNATie1-AS过表达质粒或小干扰RNA(Small interfering RNA, siRNA)，RT-qPCR验证过表达或敲除效率。RT-qPCR检测Tie1RNA水平；利用WesternBlot和免疫荧光检测Tie1蛋白水平。给予不同时间梯度的鹅膏蕈碱，阻断RNA合成，RT-qPCR检测各时间点Tie1RNA水平。
19.LCM的宫颈癌组织标本中，RT-qPCR检测Tie1RNA水平，分析lncRNATie1-AS和Tie1RNA水平相关性。
20.HeLa细胞中利用质粒过表达lncRNATie1-AS，RT-qPCR检测其六个邻近基因KDM4A、CDC20、YBX1、EDN2、PRPRF和SLC2A1的RNA水平。
21.LCM的宫颈癌组织标本中，RT-qPCR检测上述六个邻近基因的表达，分析lncRNATie1-AS和它们mRNA水平相关性。
22.SiHa和HeLa中利用质粒共转染同时上调lncRNATie1-AS和Tie1，Transwell侵袭实验和划痕实验分别检测细胞的侵袭和迁移能力。
研究结果
1.和正常宫颈上皮相比，Tie1在宫颈癌上皮组织中表达增高，且主要分布在细胞膜和细胞质中。TCGA数据库分析显示Tie1高表达与宫颈癌的不良预后密切相关。体外细胞实验表明上调Tie1后，宫颈癌细胞的迁移侵袭能力增强，但细胞增殖及干性无明显改变。
2.宫颈癌细胞中Tie1基础磷酸化水平较低，hAng1刺激不能显著增强Tie1的磷酸化。
3.SiHa和HeLa细胞中，Tie2激酶抑制剂不能逆转Tie1促进侵袭迁移的作用。
4.质谱鉴定得到Tie1结合蛋白1128个，经差异表达分析筛选获得了169个目标蛋白。通过对蛋白的结构和功能进行分析，确定Basigin为Tie1可能的下游分子。生物信息学分析显示，GO数据库中，Tie1结合蛋白(n=169)在正向调控细胞迁移的通路中富集；KEGG数据库中Tie1结合蛋白显著富集在HPV感染以及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)等多种信号通路中。
5.Tie1与Basigin存在结合，且上调Tie1能减弱Basigin的降解，促进Basigin及其下游的MMP2和MMP9的表达。Basigin功能抑制性抗体可以逆转Tie1促进侵袭迁移作用。
6.和正常宫颈上皮相比，lncRNATie1-AS在宫颈癌上皮组织中低表达，且主要位于细胞核。体外细胞实验表明上调lncRNATie1-AS后，宫颈癌细胞的侵袭迁移被抑制，但对细胞的增殖没有明显影响。
7.LncRNATie1-AS能负向调控Tie1的水平，并降低Tie1RNA的稳定性。过表达Tie1可以逆转Tie1-AS抑制侵袭迁移的作用。虽然lncRNATie1-AS主要位于细胞核，但并不影响其邻近基因的表达水平。
结论
宫颈癌中,lncRNATie1-AS低表达能介导Tie1水平升高。Tie1通过与膜蛋白Basigin结合减少其降解，增强了Basigin及其下游信号通路MMP家族蛋白的表达，从而促进了宫颈癌细胞的迁移侵袭。